[发明专利]在两个功能性亚结构域中具有突变的LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体及其用途

说明书

本发明涉及用于改造出在两个功能性亚结构域中具有突变的 LAGLIDADG归巢核酸内切酶变体的方法，其中每个亚结构域与经修饰的 DNA靶标半位点的不同部分结合，所述LAGLIDADG归巢核酸内切酶变 体能够切割包含与每个亚结构域结合的核苷酸的嵌合DNA靶序列。

本发明还涉及可通过所述方法获得的LAGLIDADG归巢核酸内切酶 变体，编码所述变体的载体，经所述载体修饰的细胞、动物或植物，以及 所述I-CreI核酸内切酶变体和衍生产物用于遗传工程、基因组治疗和抗病 毒治疗的用途。

大范围核酸酶的定义是：具有大的(＞14bp)切割位点的序列特异性 核酸内切酶，其可以在活细胞中特定基因座引起DNA双链断裂 (double-strand break，DSB)(Thierry和Dujon，Nucleic Acids Res.，1992， 20，5625-5631)。大范围核酸酶已用于在培养细胞和植物中在其靶序列附 近引发同源重组(Rouet等，Mol.Cell.Biol.，1994，14，8096-106；Choulika 等，Mol.Cell.Biol.，1995，15，1968-73；Donoho等，Mol.Cell.Biol，1998，18， 4070-8；Elliott等，Mol.Cell.Biol.，1998，18，93-101；Sargent等，Mol.Cell. Biol.，1997，17，267-77；Puchta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93， 5055-60；Chiurazzi等，Plant Cell，1996，8，2057-2066)，这使得大范围核 酸酶诱导的重组成为基因组工程有效且有力的方法。长久以来，应用大范 围核酸酶诱导的重组受到天然大范围核酸酶组成成员的限制，当前技术的 主要限制是需要在目的基因座中预先引入大范围核酸酶切割位点。因此， 制备具有特定的底物特异性的人工大范围核酸酶正在深入研究中。这样的 蛋白质可用于切割天然染色体序列，并为基因组工程的广泛应用开劈了新 的前景。例如，大范围核酸酶可用于诱导纠正与单基因遗传病相关的突变， 并避免了由于当前基因治疗方法中使用的随机插入转基因所导致的风险 (Hacein-Bey-Abina等，Science，2003，302，415-419)。

最近，可以将Cys2-His2型锌指蛋白(ZFP)的锌指DNA结合结构域 与FokI核酸内切酶的催化结构域融合，从而诱导多种细胞类型中的重组， 包括人淋巴样细胞(Smith等，Nucleic Acids Res，1999，27，674-81；Pabo 等，Annu.Rev.Biochem，2001，70，313-40；Porteus和Baltimore，Science， 2003，300，763；Urnov等，Nature，2005，435，646-651；Bibikova等， Science，2003，300，764)。ZFP的结合特异性相对易于操作，现在可得到 能结合许多(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn序列的多种新人工ZFP(Pabo等，前文引 用；Segal和Barbas，Curr.Opin.Biotechnol.，2001，12，632-7；Isalan等， Nat.Biotechnol.，2001，19，656-60)。然而，基因组工程应用的一个主要问 题是保留非常窄的特异性，而目前尚不清楚ZFP是否满足治疗性应用的非 常严格的要求。另外，这些融合蛋白已在细胞中表现出高毒性(Porteus 和Baltimore，前文引用；Bibikova等，Genetics，2002，161，1169-1175)， 这可能是由于特异性水平低所致。

在自然界中，大范围核酸酶基本上以归巢核酸内切酶(homing endonuclease，HE)为代表，所述归巢核酸内切酶是由可移动遗传元件编 码的核酸内切酶家族，其功能是在称作“归巢”的过程中起始DNA双链断 裂(DSB)诱导的重组事件(Chevalier和Stoddard，Nucleic Acids Res.，2001， 29，3757-74；Kostriken等，Cell；1983，35，167-74；Jacquier和Dujon，Cell， 1985，41，383-94)。已在细菌、真核生物和古细菌中鉴定出几百种HE (Chevalier和Stoddard，前文引用)；然而在所选基因中发现HE切割位 点的概率却极低。