[发明专利]RNA的提取方法及RNA的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使存在于样本等中的RNA分解酶失活的方法、简易而且稳定地从存在于该样本中的RNA包含体(细胞、真菌、细菌、病毒等)或者从该样本中分离的RNA包含体中提取RNA的方法、检测该RNA的方法以及在这些方法中使用的试剂。本发明涉及RNA扩增法，尤其涉及利用逆转录-聚合酶链反应((Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，以下简称为RT-PCR)法的RNA扩增法。

背景技术

为了配制在分子生物学分析中使用的RNA，必须在RNA分解酶(RNase)不发挥作用的环境下配制RNA。通常必需从被检验物中分离回收细胞、真菌、细菌、病毒等(以下总称为RNA包含体。)，然后从该RNA包含体内部提取RNA，纯化提取的RNA的过程。但是，RNase是不均匀存在而且很难失活的物质。所以，在从生物等样本中的RNA包含体中纯化RNA时，不得不进行从RNA包含体内部提取RNA过程中的RNase控制(活性的抑制)和RNase除去，必需极为严格而且烦杂的方法。因此，作为进行该过程的方法，过去使用的是用苯酚或苯酚·氯仿等提取及纯化RNA的方法。最近，在RNA提取及纯化的过程中，还有使用离子交换树脂、玻璃过滤器、玻璃珠、磁珠或者具有蛋白凝集作用的试剂等方法的报告。RNA的提取及纯化法在Chomczynski&Sacchi(1987)分析化学(Analytical Biochemistry)，162：156-159.(酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)法：AGPC法)；或分子克隆(Molecular Cloning)：实验室手册第三版(ALaboratory Manual Third Edition)(2001)Joseph.Sambrook，David W.Russell等中有记载。

RT-PCR法是使用逆转录酶(Reverse Transcriptase)将RNA转换成互补的DNA(cDNA)之后，用PCR法扩增cDNA的方法。RT-PCR由于可以用微量的RNA进行定量分析，所以目前被用作检测灵敏度最高的定量性出色的分析法之一。正在成为在例如保有RNA作为基因的病毒的检测、mRNA的定量检测、利用mRNA的碱基序列决定的表达基因的分析、进而利用cDNA的克隆的表达产物的分析以及生产等中不可缺少的技术。

在RT-PCR法中，接着RT反应进行的PCR法是可以通过反复进行夹持DNA链中的特定区域的引物(primer)之间的DNA合成反应，而将目的DNA片断扩增至数十万倍的方法。PCR法在作为マリス氏等的发明的特开昭61-274697号公报中有记述。

但是，以所述方法为主的RNA扩增法由于全部以酶反应作为基础，所以存在于生物样本中的色素、蛋白、糖类或者未知的夹杂物强烈地妨碍反应已被广泛认识。

进而，RNA容易被普遍存在于全部生物样本中的RNA分解酶(RNase)分解。

因此，如上所述，在所述的RNA扩增之前，必须从被检验物分离细胞、真菌、细菌、病毒等(以下称为RNA包含体)，然后从该RNA包含体提取纯化RNA的过程。例如，在美国专利第6825340号说明书或美国专利第6777210号说明书中公开了在还原剂的存在下通过进行加热处理，进行RNase的失活以及从用PBS清洗后的培养细胞中的RNA提取和RT-PCR。

另一方面，在特开2001-29078号公报中还公开了从含有RNA包含体的样本直接进行RT-PCT。

关于不伴随RNA扩增的病毒检测技术，在特开2004-301684号公报中公开了使用碱性缓冲剂的诺罗病毒标本用稀释液以及使用该稀释液的利用抗原抗体反应的诺罗病毒检测。

非专利文献1：Comczynski以及Sacchi，“分析化学”，1987年，第162卷，p.156-159.

非专利文献2：Joseph.Sambrook以及David W.Russell，“分子克隆：实验室手册第3版”，2001年

专利文献1：特开昭61-274697号公报

专利文献2：美国专利第6825340号说明书

专利文献3：美国专利第6777210号说明书

专利文献4：特开2001-29078号公报

专利文献5：特开2004-301684号公报

发明内容