[发明专利]单链引物-启动子-选择子构建体的IVT的应用

说明书

相关申请

本专利申请要求2005年9月21号提交的60/719063号美国临时申请 的优先权。

潜在政府利益声明

本发明开发的部分资助来源于美国军队实施的一个项目下的SBIR(小 型商业创新研究)，授权号为DAMD17-03-C0047C。政府可能拥有本发明中 的一些权利。

发明背景

利用体外转录(即IVT)进行mRNA或基因组DNA的线性扩增，是公知 的分子生物学方法(参见Krieg & Melton，1984；Melton，1984)。对于 每一个靶标，IVT产生与该靶标起始拷贝数成比例的RNA产物数，所以它 可以用于相对信使丰度的确定(5,545,522、5,716,785、5,891,636号美 国专利，Van Gelder等，1990)，并且由此已广泛应用于基因表达分析 (5,514,545号美国专利)。IVT也是某些能够检测低水平病原体RNA或 mRNA的靶标指数扩增的等温方法中的一个中心环节(5,399,49号美国专 利，0368906B2号欧洲专利，Guatelli等，1990)。

根据现有技术，如6,291,170号和5,514,545号美国专利，以及 2005/0130194号和2005/0123943号美国专利申请所公开的技术，常规的 步骤顺序如下：进行cDNA合成，多用一个与RNA聚腺苷酸3’末端互补 的引物，所述RNA的5’末端包括T7启动子序列(非模板链)；可选地， 序列或基因特异性引物可以置于除5’末端以外的位置。在RNA酶H消化 RNA模板或热变性RNA-DNA杂合体之后，进行第二链DNA的合成 (Goubler，U.，1983)，产生全长或部分长度的双链DNA(依赖于引物放 置)，该双链DNA中引入了一个双链T7启动子序列(以及相邻区域)。在 该方法的实际实现的过程中，必须向反应物加入DNA聚合酶或RT以有效 催化第二条链的合成(参见5,545,522号美国专利，描述了大肠杆菌(E. Coli)DNA聚合酶的使用；Kwoh等，1989)。反义RNA(aRNA)通过 体外转录从第二条链合成，aRNA产物通过例如与捕获寡核苷酸探针杂交 来检测，包括变式如分子信标(Vet，J.A.M.，2002；也可见BioArray Solutions 的专利申请，序号11/218838，提交日期2005年2月9日，如下)或杂交 保护试验(参见6,004,745号美国专利，Arnold等)，或者探针延伸。该领 域的所有这些方法都需要从最初的mRNA靶标合成双链cDNA，以及插入 RNA降解步骤。这些方法复杂而费时的步骤实际上将它们局限在实验室研 究中。在临床条件下，运用如此复杂的实验方法需要对有资格操作如此复 杂的(神秘的)分析的实验室技术人员进行特殊训练，并通常要认证。

核酸检测和序列分析-IVT还可以用于DNA分析，包括突变或多态 分析。通常，这些应用需要对基因材料(即基因组DNA)进行指数扩增， 多采用聚合酶链式反应(Syvanen，A.C.，2005；参见，例如4,683,202号美国 专利，Mullis)或多种变式的全基因组扩增(参见，例如USCD关于连接 介导的全基因组扩增的专利，美国专利号为5,686,243)。IVT提供了一种 PCR扩增之后的链选择的方法(参见，例如BioArray Solutions在2005年2 月9日提交的专利申请，序号11/218838，提交(IVT))，该方法尤其具有 下述优点：容许该步骤和随后在IVT反应中产生的RNA链的多重检测相 结合。

简化和加速可信的多重扩增和检测反应，用适合临床条件的更简单更 稳健的实验方法替换基因表达分析(5,514,545号美国专利)和其它核酸分 析任务的复杂过程，将非常有用。尤其在那种情况下，开发整合多个分析 步骤的整合实验方法也会有用，所述整合优选以允许实现相同测定形式 (homogeneous assay format)的方式。为了缩短完成测定需要的时间，尤 其是实际操作的时间，通过多个扩增产物的检测以整合扩增和分析过程将 特别有用。并且，步骤的整合，最好是以与实现相同测定形式相容的方式， 将推进小型化，这反过来将减少试剂的消耗和以及样品和实验室设备的污 染。

IVT反应，特别是本文所描述的利用单链模板(而非双链模板)的IVT 反应，具有上述优势中的许多优势。