[发明专利]用于鉴别大量野生型DNA背景中多个DNA突变标记的方法

权利要求书

1.一种用于生产足够纯的突变体DNA片段的方法，所述突变体DNA片 段是用于测定大量野生型DNA背景中多个DNA突变位点的突变状态，所述 方法包括：提供含有突变体DNA和野生型DNA的DNA样品；通过多重PCR 扩增包含突变位点的DNA序列，从而生产扩增子；以及，同时从PCR的扩增 子中富集具有突变的突变体DNA片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA突变选自由一个或多 个单碱基(i)取代、(ii)插入、(iii)缺失和(iv)它们的组合所组成的组中。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA样品来源于收集自患 者的临床生物样品，所述生物样品选自由人肿瘤组织、外周血、粪便、尿、体 液、与医疗过程相关的冲洗液以及它们的组合所组成的组中。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述DNA样品中野生型DNA 与突变体DNA的摩尔比为约2∶1至约100,000∶1。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多重PCR使用两对或两对以 上的PCR引物，其中每一对引物与含有一个或多个突变位点的序列杂交用于 扩增所述序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，富集突变体DNA片段是通过选 自由以下所组成的组中的操作进行的：(i)减少野生型DNA，(ii)选择性俘 获突变体DNA，以及(iii)(i)和(ii)的组合。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从多重PCR的扩增子中富集 合有突变的突变体DNA片段通过以下(i)和(ii)的至少之一进行：(i)突 变特异性杂交和提取，以及(ii)竞争性突变特异性杂交和提取。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，富集是通过突变特异性杂交和提 取进行的，这是通过以下过程进行的：在杂交条件下使多个突变体特异性探针 与多重PCR的扩增子接触，其中突变体特异性探针优先与突变体序列形成杂 交物，其中还将所述突变特异性杂交探针连接到第一结合分子上，所述第一结 合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；其中在杂交之后，使 所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所进行的突变体特异性富集循环 的循环数范围为1至5个循环。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述循环数为1个。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述循环数为2个或2个以上。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，重复所述突变特异性杂交和提 取，其中将被所述固体载体提取的DNA片段从固体载体中释放出来，然后进 行另外的突变特异性富集和提取的循环。

13.根据权利要求8所述的方法，其中，所述突变体特异性探针选自由寡 核苷酸、肽核酸、锁核酸以及它们的组合所组成的组中。

14.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一结合分子选自由生物素、 链霉亲和素以及它们的组合所组成的组中，所述第二结合分子选自由链霉亲和 素、生物素以及它们的组合所组成的组中。

15.根据权利要求7所述的方法，其中，富集是通过竞争性突变特异性杂 交和提取进行的，这是通过以下过程进行的：在杂交条件下使多个突变体特异 性探针和正常竞争探针与多重PCR的扩增子接触，其中每一个突变体特异性 探针优先与突变体序列形成杂交物，而其对应的正常竞争探针优先与对应的野 生型序列形成杂交物，其中还将所述突变体特异性探针连接到第一结合分子 上，所述第一结合分子能够与连接到固体载体上的第二结合分子相结合；其中 在杂交之后，使所述杂交物被含有第二结合分子的所述固体载体俘获。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所进行的竞争性突变特异性杂 交和提取的循环的循环数范围为1至5个循环。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述循环数为1个。