[发明专利]用于鉴别大量野生型DNA背景中多个DNA突变标记的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年10月14日提交的美国临时申请60/727,168的优先权。 本文将美国临时申请60/727,168通过引用作为参考。

背景技术

尽管有成像技术的最新进展，癌症仍然经常在转移已经发生之后才被诊断 出来。作为转移之后检出的结果，出现来自癌症的不必要的死亡。因此，在转 移之前检出癌症具有急迫的社会优先性。

一种用于这种早期检出的方法是分子检测法。使用分子标记来检测癌症的 分子检测法是作为一种用于癌症筛查的具有吸引力的方法而出现的，是因为它 能够允许医师通过分析一滴体液或少量的粪便样品在最早的阶段检出癌症。

DNA突变和异常的基因甲基化是最常见的导致癌症发育的DNA变异现 象。例如，在大约50～60％的所有癌症中，出现基因p53突变。在许多种类的 癌症中发现了异常的基因甲基化。因此，DNA突变和甲基化用作癌症的指示 物或标记，因此如果被鉴别出来，可以用于诊断癌症。因为这一点，努力开发 基于DNA的检测方法来筛查癌症。例如，开发了基于突变分析几个基因的粪 便DNA检测法用于筛查结肠直肠癌(CRC)。

尽管被用作癌症指示物，当用于筛查时突变分析仍然存在技术难题。这是 因为两个原因。首先，检出临床样品的突变需要高灵敏度的方法。因为临床试 样在极其大量的野生型序列中含有少量的突变序列(常常小于1％)，只有高灵 敏度检测法才能够使用。此外，癌症可以由涉及不同基因中的突变累积的不同 途径引起，因此没有单个突变现象可以用作可靠的癌症指示物。因此，必须使 用一组或一系列基因来检出癌症。例如，粪便DNA检测法应用k-ras、p53、 APC和BAT26的突变作为标记来检测结肠直肠癌。此外，基因突变常常发生 在不同的碱基。例如，APC突变可以发生在其前1600个密码子内的任意位置。 因此，临床检测必须能够在极其大量的野生型DNA中检测出大量标记的突变 状态。

其次，癌症筛查必须是费用低廉的，因为该因素最终决定了该方法用于医 疗治疗的程度。粪便隐血试验(fecal occult testing)是一个很好的例子。粪便 隐血试验不是特别灵敏的，但是比其他方法更有成本效益。结果，粪便隐血试 验成为美国预防服务特别小组推荐用于CRC筛查的方法。事实上，对于医疗 政策制定者和/或保险公司来说，不可能接受成本高昂的筛查方法。因此，除 了提供合理的灵敏度之外，好的临床筛查试验必须是费用低廉的。

已经有许多方法用来检测突变。通常，这些方法可以分为两组。在一组方 法中，聚合酶链式反应(PCR)是检测系统的组成部分。这些方法依赖于突变 体等位基因的选择性扩增，允许灵敏检测极其大量的野生型等位基因中的突变 体等位基因。等位基因特异性扩增法(ASA)和突变体富集PCR法(ME-PCR) 是用于该用途的两个广泛使用的方法，这两个方法都能够检测出极其大量的野 生型DNA中的突变体DNA，该野生型DNA具有比突变体DNA高100,000 倍的量。不过，这些方法通过PCR富集突变体DNA，每一个PCR反应一般 检测一个突变。如前所述，必须使用大量突变来获得高的筛查灵敏度。因此， 如果使用这组方法进行癌症筛查，将需要许多PCR反应，从而增加了筛查成 本。因此，采用这组方法的检测法不是费用低廉的，因此不适合用于临床筛查。

在第二组方法中，在通过PCR将靶序列扩增之后来分析突变。可以使用 例如序列测定法、DHPLC、DNA微阵列、DGGE和SSCP的技术来分析突变。 与第一组方法不同，第二组方法可以在长的序列跨度内检测突变。不过，这些 方法不是足够灵敏的以检出大量野生型DNA背景中的突变。因此，虽然这组 方法常常被用于检测来自于突变体DNA的丰度相对高的切除肿瘤样品的 DNA突变，这组方法低的灵敏度已经阻碍了它们用于检测来自突变体DNA的 丰度较低的临床试样例如体液和粪便的DNA突变。因此，由于它们低的灵敏 度，第二组方法也不适合用于临床筛查。