[发明专利]含有磷酸酯模拟物的多聚核苷酸

说明书

发明内容

本发明涉及核酸化学领域的新物质及其制备过程。这些物质是所谓 的磷酸酯模拟物，其中羟基被相应的模拟物所取代。

具体而言本发明涉及新类型的修饰寡聚核苷酸及其制备方法。

背景技术

之前已描述了各种方法以制备带有修饰磷酸残基的核苷酸或寡聚 核苷酸。

通常利用亚磷酰胺化学在固相上制备合成(脱氧)寡聚核苷酸。具有 规定尺寸的有孔玻璃珠通常用作所述固相(以下缩写为CPG＝可控孔度 玻璃)。第一单体通过可切割基团与所述载体相连，从而在所述固相合成 完成后切割下游离的寡聚核苷酸。此外，所述第一单体含有被保护的羟 基，在此情况下通常采用二甲氧基三苯甲基(DMT)作为所述保护基团。 所述保护基团可以通过酸处理除去。然后，在循环过程中，在5′端，也 带有DMT保护基团的(脱氧)核糖核苷的3′亚磷酰胺衍生物继续与每次 情况下都不含有DMT保护基团的反应性基团进行偶联。作为另外一种 选择，3′二甲氧基三苯甲基保护的5′亚磷酰胺用于反向寡聚核苷酸合成。 特别地，还可以采用H-膦酸酯策略以在所述磷酸骨架上引入修饰，例如 来制备放射性标记的硫代磷酸酯。也已经公知用于制备经修饰的或者经 标记的寡聚核苷酸的多种策略：根据现有技术采用三官能载体材料制备 在3′端进行标记的寡聚核苷酸(US 5,290,925，US 5,401,837)。其中所述 标记基团通过C3～12连接子被连接到亚磷酰胺上的经标记的亚磷酰胺 通常用于制备在5′端进行标记的寡聚核苷酸(US 4,997,928，US 5,231,191)。此外，也可以在个别碱基上(US 5,241,060，US 5,260,433， US 5,668,266)或者通过引入内部非核苷连接子(US 5,656,744，US 6,130,323)对寡聚核苷酸进行修饰。

作为另外一种选择，可以通过硫代磷酸酯的合成后标记(Hodges， R.R.，等Biochemistry 28(1989)261-7)或者通过对官能化亚磷酰胺进行 后标记(Agrawal，S.，Methods in Mol.Biology 26(1993)，Protocols for Oligonucleotide Conjugates，Humana Press，Totowa，NJ，Chapter 3)对核 苷间磷酸酯进行标记。然而，由于所述亚磷酰胺和磷酸硫酯的不稳定性， 这些方法尚未被接受。

从现有技术还已知可以在寡聚核苷酸的核苷间磷酸残基上引入修 饰。在最主要的情况下为硫代磷酸酯(Burgers，P.M.，和Eckstein，F.， Biochemistry 18，(1979)592-6)，甲基膦酸酯(Miller，P.S.，等， Biochemistry 18(1979)5134-43)或硼烷磷酸酯(WO 91/08213)。为制备甲 基膦酸酯寡聚核苷酸需要合成特别的单体。与之相比，可以用传统亚磷 酰胺或H-膦酸酯来合成硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯，在此情况下可以在寡 聚核苷酸合成之中或者之后通过使用与三价H-膦酸酯或与膦酸三酯进 行反应的特殊试剂直接将所述硼烷或硫修饰引入。尽管所有这些方法都 形成经修饰的寡聚核苷酸，但为此所需要的合成化学并不允许在寡聚核 苷酸合成时在所述寡聚核苷酸链的磷酸骨架上直接引入能以此方式被 检测到的标记或官能团。

Baschang，G.，和Kvita，V.，Angewandte Chemie 85(1)(1973)43-44描 述了核苷酸磷酸三酯与叠氮化物诸如甲基磺酰基叠氮化物进行反应制 备三烷基(芳基)酰亚胺磷酸酯，然而其却是不稳定的和易分解的。

Nielsen，J.，和Caruthers，M.H.，J.Am.Chem.Soc.110(1988) 6275-6276描述了在烷基叠氮化物存在下带有2-氰基-1，1-二甲基乙基保 护基的脱氧核苷亚磷酸酯的反应。此外，作者建议该原理适用于制备在 磷酸残基上进行修饰的核苷酸而无需说明利用所公开的具有特别优势 的方法制备了何种类型的修饰。特别地，作者建议了烷基残基的引入。

WO 89/091221公开了N-烷基亚磷酰胺或其他在至少一个磷酸残基 上用N-烷基取代的寡聚核苷酸，它们是在合适的烷基胺的存在下通过用 碘氧化核苷亚磷酸酯(带有保护基团)而制备的。

WO 03/02587公开了经修饰的寡聚核苷酸的制备，其中通过胺化将 H-磷酸酯转变为氨基磷酸酯。