[发明专利]包括破坏血球成分的步骤的样品中亲和物质的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用了载体颗粒的凝集反应的亲和物质的测定方法。

背景技术

作为检测或测定生物学的特异反应性物质存在的方法，目前一直使用着例如酶免疫测定法或放射线免疫测定法等。这些方法具有高的灵敏度，且精度也高。但是，由于使用酶或放射性同位素作为标记，故试剂不稳定。另外，在利用放射性同位素时，由于保管及保存上受限，故在测定时要求认真的考虑和熟练的技术。因此，要求更为简便的测定方法。而且，由于这些方法在测定时需要较长的时间，故难以应对紧急的检查。在这样的背景下，高灵敏度且迅速的测定方法的研究开始盛行。

1970年以后，以载体颗粒的凝集为指标测定免疫反应的分析方法得到实用化。该方法可通过光学测定载体颗粒的凝集程度来进行定量的分析。利用胶乳颗粒作为载体颗粒的光学测定免疫学的颗粒凝集反应的方法称为胶乳凝集比浊法。这些分析方法的反应温度通常在37～45℃的范围内进行，通过利用搅拌翼等进行搅拌，进行特异性凝集反应。此时，测定(反应)所需要的时间约为10～20分钟，比酶免疫测定法或放射线免疫测定法快。另一方面，在测定灵敏度或测定范围方面，据说不如酶免疫测定法等。

胶乳凝集法中的粒度分布测定法也是公知的(非专利文献1/Cambiaso CL，J.Immunol.Methods.1977，18(1～2)：33～44；非专利文献2/松泽等，化学和工业，第36卷，第4号，206～208页，1983)。胶乳凝集比浊法测定颗粒悬浊液的透光率，与此相对，在粒度分布测定法中测定分散后各个颗粒的状态和数量。在Cambiaso等的报告中，在37℃下使抗体结合于粒径0.8μm的胶乳的试剂与抗原反应20分钟。对反应后的颗粒数进行计数，根据凝集造成的颗粒数的减少水平测定抗原。颗粒数利用以激光散射光为原理的计数器进行测定。

另一方面，松泽等使抗体与粒径1μm的胶乳颗粒结合的试剂与抗原反应6小时。在反应后，利用电阻法测量平均颗粒容积，测定抗原。但是，实用化且普及了的只有使用了鞘流型激光散射法的PAMIA系统(SYSMEX株式会社)。PAMIA中使用粒径0.78μm的胶乳颗粒。在45℃下反应15分钟后，对胶乳颗粒进行计数，进行免疫测定。PAMIA与胶乳凝集比浊法相比，具有高的灵敏度，但据说与放射免疫测定法(RIA)和酶免疫测定法(EIA)等高灵敏度免疫测定相比，则灵敏度不好。

在胶乳凝集比浊法中，通常使用粒径0.05～0.6μm的胶乳颗粒。在胶乳凝集粒度分布解析法的情况下，这样小的颗粒容易受到测定干扰物质的影响。例如，在血液和尿等体液中共存有脂质、蛋白、血球成分等。这些共存物质难以与载体颗粒识别。因此，存在不能对载体颗粒进行正确计数的情况，为避免这些测定干扰物质的影响，开始使用较大的颗粒。另一方面，如松泽等所述，当粒径为1μm左右时，由于难以产生凝集反应，故使用了0.8μm左右的胶乳颗粒。另外，松泽等在测量平均颗粒容积时使用的小孔(细孔)的口径为30μm。该尺寸容易受到小孔堵塞的影响。但是，利用口径比其大的小孔不能检测0.8～1μm的颗粒。

另外，为促进生物学的特异性凝集反应，且容易地检测到形成的凝集块，对反应系统施加交流电压的方法是公知的(专利文献1/日本特开平7-83928号)。该方法通过载体颗粒的生物学的特异性凝集反应检测或测定生物学的特异反应性物质的存在，特征在于对该反应系统施加交流电压，在10mM以上的盐共存下达到5～50V/mm的电场强度。

电场中的载体颗粒沿电场直线排列(珠链化)。之后，当将电场停止时，则直线排列的载体颗粒再分散。在珠链化时，若生物学的特异反应性物质存在，则在将电场停止后也不会引起载体颗粒的再分散，进一步确认了珠链化的载体的存在。上述测定方法利用该现象。即，在电场中，生物学的特异反应性物质的反应得到促进。而且，如能在将电场停止后使载体颗粒再分散，则可检测到反应生成物。利用了珠链化的免疫学测定方法，通过以三维信息为指标对载体颗粒进行计数，可以进一步改善其测定精度(专利文献2/PCT小册子WO2004/111649)。

专利文献1：日本特开平7-83928

专利文献2：WO2004/111649

专利文献3：日本特开平10-48214

专利文献4：日本特开2002-107365

专利文献5：WO2001/96868

非专利文献1：Cambiaso CL，J.Immunol.Methods.1977，18(1～2)：33～44