[发明专利]抗乙型肝炎病毒核酶核酸

说明书

发明领域

本发明属于重组DNA技术领域，尤其涉及核酶技术，特别涉及抗乙型肝炎病毒(HBV)核酶的设计。

发明背景

世界范围内乙型肝炎病毒(HBV)感染很多人。接种疫苗是行之有效的预防措施，然而对于感染HBV的人来说，已经长久期待一种高效的疗法。介入治疗提供给HBV患者唯一的希望是通过阻止HBV的复制从而降低疾病的进展。已经提出很多抗HBV的疗法，并且可在一定程度上减轻该疾病，但是没有提供与该病毒作斗争的有效的疗法。

HBV基因组由3.2kb的部分双链环状DNA组成。HBV利用前基因组RNA进行复制。前基因组RNA表征为3.5kb的序列，比基因组(3.2kb)长，通过病毒聚合酶反转录。这种RNA的两端具有独特的由60个碱基组成的茎-环结构，这种茎-环结构称为ε环。已知5’端的ε环在前基因组RNA的包衣壳化中起到重要作用，并且也在反转录前为聚合酶提供结合位点。

通过利用重组DNA/RNA以调节基因表达并且特异靶向病毒基因组以终止其复制的方法已经提供了十分有效的治疗工具。核酶是特异靶序列的催化性RNA分子，以前已经被用来除去HBV。已经设计了抗HBV的锤头结构核酶来减少前基因组RNA和其蛋白质的mRNA。这些核酶被设计成能靶向HBV前基因组RNA上的三个不同位点(von Weizsacker等人，1992)。其他研究人员设计锤头结构核酶可结合并适度切割ε-环区(Beck和Nassal，1995)。锤头型核酶也被用来靶向HBV序列中编码基因X的RNA序列(Kim等人，1999，及Weinberg等人，2000)。

由于设计和合成方法的原因，先前设计的抗HBV的锤头结构核酶不能有效切割它们的靶。根据本发明的HBV核酶可在体外完全切割靶HBV序列。利用根据本发明的两个或更多核酶可导致在两个或更多不同的位点切割靶HBV信使RNA或者前基因组RNA。严格地，核酶是切割靶RNA的RNA分子。一些文献使用该术语来描述转录为RNA的DNA分子，因此产生了核酶本身。在本说明书中，术语“核酶DNA”指可转录为核酶本身的DNA。

发明概述

本发明的核酶及其在体内转录的相应核酶DNA分子被设计成能切割在HBV信使RNA或者前基因组RNA中的CUC位点。众所周知，通常核酶的治疗用途是通过使用配对物DNA，通常将其并入载体诸如质粒载体的方式来完成的。

根据本发明的核酶的设计和构建将在下文详细描述，本文通过制备三个名为MAZI、SGIII和DGII的锤头结构核酶举例说明。表1显示相对于HBV序列(表示为cDNA)这些示例的核酶在HBV mRNA上的切割位点。

从GCG(Acc.No.Y07587)获得HBV序列(AYW菌株)、ε-环区域(1848-1910)的上游500个碱基和下游500个碱基的序列。利用计算机程序‘mfold’(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html)预测HBVRNA的二级结构以确定无NUX位点，即不涉及形成链的强结合，并针对无NUX位点设计的锤头型核酶设计二级结构。选择的NUX位点全部都是CUC位点。

通过已经设计的三个反式作用锤头结构核酶作为实例，作为HBV RNA有效切割剂的全部三个锤头结构核酶在5′端由稳定环为先导并且后面有一个或多个额外的茎环结构。通常在反式作用元件的3′端后有顺式作用核酶。整个说明书中常常将核酶的设计称为RNA核苷酸，这些RNA核苷酸是在HBV RNA靶位点有效的分子种类。然而值得注意的是体内施用的可实现切割HBV RNA的治疗剂则需存在于合适的载体系统中的相应的DNA多核苷酸。

一方面，本发明提供一种包含至少一个DNA载体的载体系统，该载体包含在对人类细胞有效的启动子控制下的靶向切割的锤头型核酶DNA序列，其一旦转录为RNA将在CUC切割位点切割从编码HBV RNA的靶基因转录的mRNA。

核酶DNA序列与启动子的连接可以是直接的，并且仅仅需要使用单个载体。然而，优选间接连接，其可增强启动子的作用。通常这样的间接连接将需要两个或更多载体。因此，本发明包括包含至少两个DNA载体的载体系统，其中第一个载体包含对人类细胞有效的第一启动子，第一启动子有效连接于可表达产生能作用于第二启动子的激活蛋白的基因，和第二个载体包含有效连接于上述靶向切割锤头结构核酶DNA序列的第二启动子。核酶DNA序列可包含在两个或更多位点切割HBV RNA的复合序列。本文使用的术语“载体系统”是包含单个载体或者试剂盒或者组合物或者两个或更多载体的通用术语。