[发明专利]活化的分裂多肽及其制备方法和用途

说明书

相关申请的交叉参考

本申请根据35 U.S.C.119(e)要求于2005年10月27日递交的第60/730,752 号美国临时专利申请的优先权，该申请的内容在此全文引入作为参考。

领域

本发明提供新的活化的分裂多肽蛋白，用于快速生物分子蛋白互补，以 及该活化的分裂多肽蛋白的制备方法和用途。

背景

蛋白互补是一种相对较新的方法，在该方法中，蛋白分裂成两个或两个 以上的无活性片段，该无活性片段能够重新组装来形成活性蛋白。使用无活 性分裂多肽片段的一个局限在于重组，它们需要进行再折叠和重新组装从而 形成活性蛋白。这些差的折叠性质限制了无活性分裂多肽在以快速动力学实 时检测生物分子相互作用的方法中蛋白互补中的使用。

目前，GFP及其众多的相关荧光蛋白被广泛地用作蛋白标记试剂(用于综 述，参见Verkhusha等人，2003，第18章，第405-439页)。此外，GFP已 经被用作末端融合的测试蛋白的溶解性指示物(Waldo等人，1999，Nat. Biotechnol.17：691-695；美国专利No.US 6,448,087)。GFP样蛋白是同源的扩 展家族，是共同具有保守的11条β链的“桶”结构的25-30kDa多肽。GFP 样蛋白家族目前包括约100个成员，克隆自各种珊瑚虫类和水螅纲类，并且 包括红色的、黄色的和绿色的荧光蛋白以及多种无荧光的染色体蛋白 (Verkhusha等人，见上文)。广泛的各种荧光蛋白标记分析方法和试剂盒可以 商业购买得到，其中包括广谱的GFP光谱变体和GFP样荧光蛋白，包括 DsRed和其它红色荧光蛋白(Clontech，Palo Alto，Calif；Amersham， Piscataway，NJ.)。

用于改善GFP和相关蛋白的溶解性的多种策略已经被记载，并由此导 致产生许多具有改进的折叠性能、溶解性和干扰耐受性的突变体。现有的蛋 白标记和检测平台是十分有效的，但是存在缺点。分裂蛋白标记会干扰 (perturb)蛋白的溶解性(Ullmann，Jacob等人，1967；Nixon和Benkovic 2000； Fox，Kapust等人，2001；Wigley，Stidham等人，2001；Wehrman，Kleaveland 等人，2002)或者在活细胞中不起作用(Richards和Vithayathil 1959；Kim和 Raines 1993；Kelemen，Klink等人，1999)。绿色荧光蛋白融合物会发生错 误折叠(Waldo，Standish等人，1999)或者其加工会发生改变(Bertens，Heijne 等人，2003)。含砷荧光团FLaSH或ReASH(Adams，Campbell等人，2002) 基底能够克服许多这些缺陷，但是它需要聚半胱氨酸标记基序，还原环境， 以及细胞转染或渗透作用(Adams，Campbell等人，2002)。

GFP片段重组系统已经被描述，主要是用于检测蛋白与蛋白之间的相互 作用，但是没有任何一个系统能够无需辅助地自组装成正确折叠的、可溶性 和荧光性的重组GFP。此外，在这些方法中还没有产生通用的分裂GFP折 叠报道系统。例如，Ghosh等人在2000年报道了对应于所述GFP结构中的 氨基酸1-157和158-238的两个片段，在体外或者在大肠杆菌中共表达，当 将这两个单独片段融合成能够形成反向平行亮氨酸拉链结构的卷曲螺旋序 列时，上述两个GFP片段能够重组得到一种荧光性的产物(Ghosh等人，2000， J.Am.Chem.Soc.122：5658-5659)。同样地，美国专利No.US6,780,599描述了 能够形成反向平行的亮氨酸拉链结构的卷曲螺旋用于将所述GFP分子的分 裂片段连接在一起的用途。但是，该方法需要花费两天时间来获得阳性信号， 因此在使用上太不切合实际。