[发明专利]用于鉴定细胞信号转导调节物的方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于鉴定细胞信号转导途径调节物的方法。具体地 说，涉及用于鉴定在细胞中触发分化的细胞信号转导途径调节物的方 法。可通过使祖细胞接触候选调节物来鉴定调节物。一方面，祖细胞 是多能干细胞或单能干细胞，其在分化的不同阶段被分离，并进一步 与分化过程的潜在调节物一起培养，所述调节物用于促进或抑制细胞 信号转导途径对分化的作用。

发明背景

再生医学领域对患有诸如心血管疾病、神经退化性疾病、肌肉骨 骼疾病、肝病或糖尿病的病症的患者在体内再生受损组织和器官持有 现实希望。用再生受损组织的技术包括使用再生药物在体内修复既有 的患病组织，或者使用先在体外使用(或不使用)再生药物制备的细胞 置换所述组织，然后移植体内。

在任何一种情况下，只有在能鉴定出控制细胞信号转导途径和它 们调节的下游细胞过程的特定基因、因子或调节物时，才能实现再生 医学的目标。一般认为，受控的体外干细胞分化例如可提供用于移植 的置换细胞来源。干细胞的多能性和可塑性允许它们在用某些培养条 件处理之后被定型为特定细胞类型。然而，此方法依赖于控制谱系分 化的细胞和分子事件的因子或调节物的事前鉴定。对离体干细胞使用 这些因子或调节物可以降低移植时干细胞自发分化为分支谱系的可 能性，以及就胚胎干细胞而言降低了畸胎瘤形成的风险。

这些因素或调节物还可以构成治疗基础，所述治疗的目的在于体 内移动内源干细胞，或者触发它们分化为可扩增、修复、恢复、置换 或有益于损伤组织的细胞类型。影响细胞分化并用于治疗的因素的实 例为促红细胞生成素(EPO)。EPO为促进造血前体分化为红细胞的天 然蛋白因子。重组EPO用于治疗贫血，并具有约100亿美元的全球市 场。

除了天然分子或因子以外，还有可能使用信号转导途径的合成调 节物、尤其是控制分化的途径的调节物来影响细胞分化。SB-497115 是一种由GSK开发的小分子药物，其模拟血小板生成素(TPO)的活性， 血小板生成素为促进血小板生长和生产的蛋白因子。该药物可用于治 疗血小板减少症：没有生产血小板的能力，血小板为出血时凝血过程 必需的关键成分。估计商机约为40-50亿美元。

尽管再生药物如EPO或SB-497115作用于干细胞，但还没有提 出使用干细胞、尤其是胚胎或胎儿干细胞发现再生药物的一般性方 法。

在药物发现中使用干细胞的最初尝试包括这样的试验：其中在天 然产物或合成化合物的基于细胞的表型和途径特异性筛选中使用多 潜能胚胎干细胞、自我更新成年干细胞或细胞系，以发现能够影响这 些细胞分化的物质(参见Ding和Shultz(2004)Nature Biotechnology 22: 833-840的综述)。使用这些细胞的其中一个理由是它们可易于扩增， 以产生筛选所需的量。然而，由于以下论述的众多理由，其中使用自 我更新的未分化干细胞或细胞系的现有技术方法被发现不能作为药 物发现方法。

首先，现有技术中使用的细胞类型(尤其是ES细胞和细胞系)可 能不是适于体内药物干涉的生理相关靶标。例如，尽管能够使ES细 胞分化为例如心肌细胞的因子(Wu等,JAm Chem Soc.2004: 126(6):1590-1)可能对允许由ES细胞体外产生心肌细胞有用，但ES 细胞在成体中不存在，对ES细胞具有特异性活性的任何物质都应当 没有可能用作体内再生药物。

其次，现有技术中使用的细胞类型(尤其是ES细胞和自我更新成 年干细胞)位于发育途径中靶细胞谱系上游过远的位置，以至于不能响 应于单一物质的单一应用而定向分化为该谱系。例如，已知需要连续 地定时应用已知众多因子的混合物，以将ES细胞分化为特定谱系， 尤其是由于相对复杂的组织特化过程而在发育的相对晚期特化的那 些谱系。

第三，在现有技术中使用的细胞类型(尤其是原初成年干细胞)可 能难以获得实施大规模的高通量药物筛选的足够量。

最后，用于现有技术的细胞类型(尤其是原初成年干细胞)可能响 应于药物表现出高度可变的作用，这取决于来源或分离和制备的方 法。

WO2004/031369描述了允许细胞如干细胞分化的方法和细胞信 号转导途径。在WO2004/031369所述的技术中，细胞在多个培养步骤 下于多种条件下培养，以调节细胞途径，该方法提供了确定多个不同 培养步骤方案对细胞过程如分化的作用的手段。