[发明专利]白蛋白与治疗剂的预成型偶联物的制备方法

权利要求书

1.一种偶联物的制备方法，所述偶联物包含与化合物共价连接的白蛋 白，所述方法包括采用第一次疏水相互作用层析，随后进行第二次疏水相互 作用层析来纯化所述偶联物，

其中，所述化合物包括反应基，所述偶联物是在所述反应基能与白蛋白 的半胱氨酸34巯基共价结合形成偶联物的条件下，通过将溶液中的白蛋白 与化合物接触在该溶液中形成的；

其中，所述第一次疏水相互作用层析为苯基琼脂糖凝胶层析，所述苯基 琼脂糖凝胶层析包括在5mM辛酸钠和5mM硫酸铵组成的pH7.0、20mM 磷酸钠缓冲液中预平衡；并且

其中，所述第二次疏水相互作用层析为丁基琼脂糖凝胶层析，所述丁基 琼脂糖凝胶层析包括：

a.在pH7.0，20mM磷酸钠盐缓冲液，5mM辛酸钠，750mM硫酸铵中 平衡丁基琼脂糖凝胶树脂；

b.将该丁基琼脂糖凝胶树脂与包含所述偶联物的溶液接触；和

c.运用从750-0mM硫酸铵的递减的盐梯度从非单体白蛋白种类中分离 单体偶联白蛋白种类。

2.根据权利要求1的方法，进一步包括用超滤进一步纯化所述偶联物的 步骤。

3.根据权利要求1的方法，进一步包括采用选自离子交换层析、亲和层 析、和尺寸排阻层析的方法进一步纯化所述偶联物的步骤。

4.根据权利要求1的方法，其中所述溶液包括宿主有机体分泌重组白蛋 白于其中的培养基。

5.根据权利要求4的方法，其中在所述白蛋白与所述化合物接触之前， 将所述培养基与所述宿主有机体分离。

6.根据权利要求1的方法，其中所述溶液为生产重组白蛋白的宿主有机 体的裂解液。

7.根据权利要求1的方法，其中所述溶液包括采用疏水相互作用层析纯 化的重组白蛋白。

8.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白为巯基白蛋白-富集的白蛋 白。

9.根据权利要求8的方法，其中巯基白蛋白通过白蛋白与巯基乙酸接触 进行富集。

10.根据权利要求8的方法，其中巯基白蛋白通过白蛋白与二硫苏糖醇 接触进行富集。

11.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白为去糖基化白蛋白。

12.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白为巯基白蛋白富集的去糖 基化白蛋白。

13.根据权利要求11或12的方法，其中所述白蛋白通过氨基苯基硼酸琼 脂糖亲和层析去糖基化。

14.根据权利要求11或12的方法，其中所述白蛋白通过伴刀豆球蛋白A 琼脂糖凝胶亲和层析去糖基化。

15.根据权利要求1的方法，其中所述形成偶联物的条件包括在20℃到 25℃的反应温度。

16.根据权利要求1的方法，其中所述形成偶联物的条件包括至少30分 钟的反应时间。

17.根据权利要求1的方法，其中所述形成偶联物的条件包括0.1∶1至 1∶1的化合物与重组白蛋白的最终摩尔比。

18.根据权利要求17的方法，其中所述形成偶联物的条件包括0.5∶1至 0.9∶1的化合物与白蛋白的最终摩尔比。

19.根据权利要求17的方法，其中所述形成偶联物的条件包括0.7∶1的 化合物与白蛋白的最终摩尔比。

20.根据权利要求1的方法，其中所述化合物包括氨基酸、肽、蛋白 质、有机分子、RNA或DNA。

21.根据权利要求1的方法，其中所述化合物低于30kDa。

22.根据权利要求1的方法，其中所述化合物为胰岛素、心钠肽、脑钠 肽、肽YY、生长激素释放因子、胰高血糖素样肽-1、exendin-3或exendin- 4。