[发明专利]白蛋白与治疗剂的预成型偶联物的制备方法

说明书

本申请要求2005年12月22日提交的申请号为60/753,680的美国临时申 请的优先权，其内容在此整体以参考的方式并入本文。

1.技术领域

本发明提供了白蛋白预成型偶联物(conjugate)的制备方法。本发明具体 提供了一种治疗性化合物与重组白蛋白体外偶联的方法，其中包括反应基的 治疗性化合物与重组白蛋白在溶液中接触形成偶联物。

2.背景技术

为了能够用于人体，治疗性分子必须符合严格的标准。除了安全和有效 之外，它们必须在足够的时间内以足够的数量可利用，以在人体体内达到有 效。不幸的是，许多提出的治疗性分子从人体体内不是被清除就是被降解， 或者上述全部，因此其治疗效果受到限制。许多提出的肽疗法受到上述药物 动力学缺陷的影响。

通过将它们与如白蛋白的载体分子共价偶联，一些提出的疗法在药物动 力学上已经取得突破。确实，一些白蛋白偶联物正应用于人体临床实验。

因而，需要高效和有效的方法来制备和纯化上述白蛋白偶联物。

3.发明简述

本发明提供了白蛋白预成型偶联物的制备方法。在某些方面，本发明提 供了在宿主细胞中生产白蛋白，在化合物的反应基和白蛋白半胱氨酸34之 间能够形成共价键的条件下，将所述白蛋白与包含治疗基和反应基的化合物 接触，并纯化由此形成的偶联物的方法。

在一方面，本发明提供了一种白蛋白预成型偶联物的制备方法，所述方 法包括如下步骤：在宿主细胞中生产白蛋白；部分纯化白蛋白产物以减少宿 主蛋白、抗原、内毒素等等；在有助于白蛋白半胱氨酸34和化合物反应基 偶联的条件下使白蛋白与所述化合物接触；通过一个或多个疏水相互作用层 析步骤来纯化所得的偶联物，随后可选择地进行超滤和配制。

因此，本发明的一实施方案提供了一种制备白蛋白预成型偶联物的方 法，包括如下步骤：

(a)在宿主细胞中生产重组白蛋白；

(b)从宿主细胞中纯化重组白蛋白；

(c)在反应基能与重组白蛋白的Cys34巯基共价结合的反应条件下，将纯 化的重组白蛋白与化合物接触形成偶联物，所述化合物包括反应基；和

(d)通过疏水相互作用层析纯化所述偶联物，随后可选择地进行超滤和配 制。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括在偶联反应步骤(c)之前，富集 巯基白蛋白(mercaptalbumin)，即由游离和活性半胱氨酸34组成的白蛋白。 尽管不倾向于受任何特定操作理论的限制，人们相信通过半胱氨酸、谷胱甘 肽、金属离子、或其它加成物对白蛋白半胱氨酸34巯基的氧化、或“加帽”能 够减少与所述化合物活性基的特异性偶联。因此，巯基白蛋白能够通过与现 有技术中已知的能够将加帽白蛋白-Cys³⁴转化为白蛋白-Cys³⁴-SH的试剂接触 从还原的或氧化的白蛋白异质池中富集。在某些实施方案中，巯基白蛋白能 够通过白蛋白与巯基乙酸(FGA)接触进行富集。在某些实施方案中，巯基白 蛋白能够通过白蛋白与二硫苏糖醇(DTT)接触进行富集。在一些实施方案 中，巯基白蛋白可以通过进行疏水相互作用层析来富集，所述层析使用苯基 或丁基琼脂糖凝胶，或其组合。在其它实施方案中，巯基白蛋白可以通过白 蛋白与TGA或DTT接触进行富集，随后通过疏水相互作用层析纯化，所述 层析采用苯基或丁基琼脂糖凝胶树脂，或其全部。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括在偶联反应步骤(c)之前的糖基 化白蛋白的还原反应。可通过本领域技术人员公知的任何还原糖基化白蛋白 的技术来进行非酶糖基化形式的白蛋白的还原反应。在一些实施方案中，非 酶糖基化白蛋白可通过将溶液进行亲和层析，如氨基苯基硼酸琼脂糖树脂、 或者伴刀豆球蛋白A琼脂糖凝胶、或者其组合来从白蛋白溶液中还原。

本发明的第二方面提供了一种白蛋白预成型偶联物的制备方法，其中在 液体培养基中的宿主细胞生产的重组白蛋白与化合物接触形成偶联物，其无 须从培养基中中间纯化所述重组白蛋白。因此，本发明的实施方案提供了制 备白蛋白预成型偶联物的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)在宿主细胞中生产重组白蛋白，其中宿主细胞在液体培养基中培养；