[发明专利]使用包括经间隔子附着于大分子的底物的修饰的底物的酶测量分析

说明书

技术领域

本发明涉及修饰的底物以及使用该修饰的底物来测定相对于结合的蛋白实体的游离的蛋白实体的分析和方法。

发明背景

α-2-巨球蛋白(A2M)与相关的蛋白均具有作为分子陷阱(moleculartrap)起作用的功能。多种类型的化合物，诸如激素、生长因子、细胞因子和蛋白，能够被A2M“诱捕”。A2M能够结合宿主的和异体的肽和颗粒。因为A2M能够与广泛多种的蛋白酶相互作用，有时其被称为全蛋白酶抑制剂(panproteinase inhibitor)。当蛋白酶被A2M捕获时，蛋白酶被保护而免于大的蛋白酶抑制剂和大底物，但其仍能与小的抑制剂和底物相互作用。

已充分研究的一种A2M-蛋白酶结合是在A2M中诱捕凝血酶。

凝血酶是凝血级联的关键酶(2、3)，因为除了其它事以外，还能够活化纤维蛋白原以形成纤维蛋白(4、5)，反馈以活化XI因子、VIII因子和V因子在凝血级联中升高以及活化血小板(2)。对凝血酶的控制部分地经过来自血浆蛋白抗凝血酶(AT)、肝素辅因子II和A2M的抑制作用而发生。与AT的反应通常是控制成人中凝血酶活性的主要抑制性机理。然而，在新生儿和儿童中，由于比成人更高的A2M血浆浓度，与A2M的反应被认为是显著的(6、7、8)。通过A2M多肽链的切割，导致A2M三维结构的构象变化而形成凝血酶被捕获到所述A2M分子中的产物，从而使凝血酶的活化被A2M位阻(9、10、11)。在该凝血酶-A2M复合物中，通过凝血酶氨基基团与A2M上的硫内酯基团的进一步反应，凝血酶还可共价地与A2M连接(9、12)。

由于凝血酶在凝血系统中的重要性，日益需要开发测量患者的血浆或血液中的凝血酶生成潜能的系统以评价患者的止血状态。先前测量凝血酶生成的方法涉及对活化血浆的二次抽样以检测凝血酶活性(13、14、15)或者连续使用与所述凝血酶生成活化血浆混合的底物检测凝血酶(16、17、18)。先前测定凝血酶生成的方法的主要缺点在于用于检测凝血酶活性的试剂检测与A2M结合的凝血酶以及未与A2M结合的凝血酶。在二次抽样方法的情况中，从对总凝血酶活性的分析中减去对凝血酶-A2M与底物反应的分析中的活性(用添加的AT+肝素中和游离的未结合的凝血酶之后检测)以获得游离的生理活性的凝血酶的浓度。然而，这些实验是费力的并且需要在每一血浆样品上进行两种凝血酶生成分析。此外，不能在凝结的血浆或血液中完成二次抽样分析。可选择地，使用添加至活化的凝血酶生成系统(血浆、血液等)中的凝血酶底物连续测量凝血酶生成不能直接测量未与A2M结合的凝血酶的生成。在连续分析中，通过从测量的凝血酶+凝血酶-A2M数据减去计算的凝血酶-A2M生成的假想曲线来测定生理活性的凝血酶的理论量。

已进行了多种尝试以开发能够测量血浆和血液中凝血酶潜能的分析。例如，Hemker等人的美国专利第5,192,689号涉及测定血浆和血液的内源性凝血酶潜能的方法。然而，该专利方法测量总凝血酶活性，包括单独的凝血酶以及与A2M结合的凝血酶。使用小的生色/荧光底物测量凝血酶活性，接着通过计算估计与A2M结合的凝血酶，随后将其从总凝血酶活性中减去以给出游离的生理活性的凝血酶的估计值。

澳大利亚专利申请第2003248589号涉及测量凝血酶潜能的另一方法。然而，该方法也包含从总凝血酶活性减去通过小底物检测的凝血酶-A2M复合物。

美国专利申请公开第US 2005/0221414号涉及用于测量患者血液或血浆样品中的凝血酶生成潜能的试剂盒。在该公开所描述的试剂盒中，诸如活化剂、底物、CaCl₂等的全部试剂，在容器是以干燥的混合物形式等待加入血浆或血液以分析。然而，该试剂盒还是会测量游离凝血酶以及与A2M结合的凝血酶两者。

Hemker的美国专利第6,740,496号描述了空间位阻的底物系统，该系统相较于对游离的蛋白水解酶，对蛋白酶-A2M复合物具有降低的反应性。然而，要求的底物发明完全限于具有最小10kDa大小的水溶性底物分子。通过该水溶性的位阻的底物测定游离凝血酶限于凝结的血浆或血液，这是由于很多问题，诸如：归因于通过蛋白或细胞的猝灭的对报告分子的有问题的检测；所述底物在细胞或聚合纤维蛋白上的潜能吸收或聚集；以及由极大分子的表面位阻产生的所述底物与游离凝血酶自身反应能力的丧失。

尽管在该领域有很多进展，但仍未满足对与测量游离凝血酶和与A2M结合的凝血酶相对照的，能够测量游离凝血酶的分析的需求。本发明解决了对这样的方法的需求。

发明概述