[发明专利]超氧化物歧化酶（SOD）基因及其鉴定和克隆方法

权利要求书

1.从喜玛萎陵菜获取的超氧化物歧化酶(SOD)cDNA，其为SEQ ID No. 2，其中所述cDNA含856个核苷酸碱基。

2.如权利要求1的超氧化物歧化酶(SOD)cDNA，其中所述cDNA具 有连同编码前序列和编码后序列的完整编码序列。

3.超氧化物歧化酶(SOD)基因的编码cDNA，其为SEQ ID No.3，其 中所述编码cDNA含459个核苷酸碱基。

4.一对用于扩增超氧化物歧化酶(SOD)基因的编码cDNA SEQ ID No. 3的引物，其中

正向引物为5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’；

反向引物为5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’。

5.一种鉴定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQ ID NO.3的方 法，所述SEQ ID NO.3编码具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽SEQ ID No.1， 其中所述方法包含以下步骤：

a)从萎陵菜的叶子中分离mRNA；

b)根据从步骤a)获取的mRNA合成cDNA；

c)构建萎陵菜的DNA的cDNA文库，然后在合适的载体中克隆从步骤 b)获取的cDNA；

d)筛选来自步骤c)的所述文库，然后进行用于鉴定阳性cDNA克隆的 初次、第二次和第三次筛选；

e)从步骤d)获取的阳性cDNA克隆中分离DNA；

f)利用引物扩增所述DNA，该引物包括：

正向引物：5’-GTTGTAAAACGACGTGCCAGT-3’

反向引物：5’-CACAGGAAACAGCTATGACC-3’；

g)利用不同引物对通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)扩增从步骤 e)获取的cDNA的末端以得到期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全长DNA  SEQ ID NO.2，其中所述引物包含：

正向引物GSP1:5’-CCAGTGGATTTGCTAAGCTCATGTCCA-3’

反向引物NES1:5’-GTCATC AGGGTCTGC ATGGAC AACAAC-3’

正向引物GSP2:5’-ATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATT-3’

反向引物NES2:5’-TTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAA-3’

SMART II A寡核苷酸:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCG GG-3’

3’-RACE CDS引物A:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTAC(T)₃₀N_-1N-3’

5’-RACE CDS引物：5’-(T)₂₅N_-1N-3’

通用引物混合物A:长链:5’-TAATACGACTCACTATAGGGC AAGCAGTG GTATCAACGCAGAGT-3’

通用引物混合物A:短链:5’-CTAATACGACTCACTATAGGG C-3’

巢式通用引物A:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

h)利用期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全长DNA SEQ ID NO.2从起 始密码子到中止密码子设计的一对引物扩增超氧化物歧化酶(SOD)的编码 序列SEQ ID No.3，其中所述引物具有以下序列：

正向引物:5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’

反向引物:5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’

i)将从步骤h)获取的扩增产物克隆到pQE 30表达载体中，然后将其 转化到感受态大肠杆菌细胞中以得到表达构建体；

j)通过常规方法分离质粒DNA，然后通过测序以确认所述SOD基因。

6.如权利要求5所述的方法，其中合适的载体是细菌噬菌体。