[发明专利]超氧化物歧化酶（SOD）基因及其鉴定和克隆方法

说明书

发明领域

本发明涉及超氧化物歧化酶(SOD)。超氧化物歧化酶(SOD)cDNA(SEQ ID No.2)从喜玛萎陵菜(Potentilla atrosanguinea)获取，其包含编码基因序列(SEQ ID No.3)，所述编码基因序列编码具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽(SEQ ID No.1)。 

另外，本发明还涉及一对用于扩增超氧化物歧化酶(SOD)基因的编码cDNA(SEQID No.3)的引物，其中正向引物为5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’和反向引物为5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’。 

更具体地，本发明涉及鉴定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQID NO.3的方法，该SEQ ID NO.3表达产生具有美国专利号6485950所公开的特征的超氧化物歧化酶酶蛋白(EC1.15.1.1)。 

发明背景和现有技术参考：

SOD是普遍存在于植物、动物和微生物中的一种酶，该酶保护这些生物免受由超氧化物自由基(以下指O₂^-)引起的氧化损伤。所述酶按照以下氧化还原反应将超氧化物自由基歧化成过氧化氢和氧： 

2O₂^-+2H⁺＝H₂O₂+O₂

这样，SOD在所有那些其中O₂^-生成量导致细胞损伤的反应中都具有作用。根据美国专利号6485950，我们已经从萎陵菜(Potentilla)中提取了耐高压加热的超氧化物歧化酶，该酶可以进行高压加热并在零度以下显示活性。由于萎陵菜分布在难以接近的高海拔地方，以及我们的美国专利号6485950中提及的SOD的工业意义，因此需要开发一种在大肠杆菌中产生萎陵菜的SOD的系统以便在需要时获取SOD。 

以下是涉及各种来源的SOD基因的分离和它们在大肠杆菌中表达以产生可回收数量的SOD的本领域的知识状况。可以参考文献(1)Wang，Z.，He，Z.，Shen，Q.，Gu，Y.，Li，S.and Yuan，Q.(J.of Chromatography B，2005.826： 114-121)，其在大肠杆菌中过量表达蛹虫草(Cordyceps militaris)的Cu/ZnSOD基因。 

还可以参考文献(2)Liu，W.，Zhu，R.H.，Li，G.P.，and Wang，D.C.(ProteinExpr.Purif.2002.25：379-388)，其在大肠杆菌中实现高产量的重组鸭Cu/ZnSOD的产生。 

还可以参考文献(3)Pan，S.M.，Hwang，G.B.，and Liu，H.C.(Bot.Bull.Acad.Sin.1999.40：275-281)，其在大肠杆菌中实现了稻的胞质Cu/Zn SOD的过量表达和表征。 

可以参考文献(4)Hartman，J.R.，Geller，T.，Yavin，Z.，Bartfeld，D.，Kanner，D.，Aviv，H.，and Gorecki，M.(Proc.Nat.Acad.Sci.USA.1986.83：7142-7146)，其报道了在大肠杆菌中高水平表达具有酶活性的人Cu/ZnSOD。 

可以参考文献(5)Ken，C.F.，Lin，C.T.，Shaw，J.F.，and Wu，J.L.(MarineBiotech.2003.5：167-173)，其在大肠杆菌中过量表达了斑马鱼的Cu/Zn SOD并纯化出具有活性的酶。 

可以参考文献(6)Kim，T.S.，Jung，Y.，Na，B.K.，Kim，K.S.，and Chung，P.R.(Infect.Immun.2000.68：3941-3948)，其克隆并在大肠杆菌中表达了肝片吸虫(Faciola hepatica)的Cu/Zn SOD基因。 

缺点是： 

1.没有从萎陵菜分离的SOD基因，萎陵菜是耐高压加热且在零度以下具有功能的Cu/Zn SOD的来源。 

2.没有从萎陵菜分离的并在大肠杆菌中表达的SOD基因。 

3.没有在大肠杆菌中表达以产生可高压加热的SOD蛋白的SOD基因。