[发明专利]一种载脂蛋白-J的制备方法有效
申请号: | 200710007353.4 | 申请日: | 2007-01-22 |
公开(公告)号: | CN101082045A | 公开(公告)日: | 2007-12-05 |
发明(设计)人: | 耿永健 | 申请(专利权)人: | 耿永健 |
主分类号: | C12N15/09 | 分类号: | C12N15/09;C12N15/12;C07K14/435;C12N1/21;C07K1/14;C12N15/85 |
代理公司: | 上海浦一知识产权代理有限公司 | 代理人: | 丁纪铁 |
地址: | 美国得*** | 国省代码: | 美国;US |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 脂蛋白 制备 方法 | ||
1.一种载脂蛋白-J的制备方法,其特征在于由以下工艺步骤组成:
a、采用脱氧核糖核酸DNA重组技术制备重组人或哺乳动物的载脂蛋白-J全长或部分片段并用亲和层析法纯化;
b、采用逆转录-多聚脱氧核糖核酸合成酶链反应RT-PCR技术从RNA克隆并扩增出载脂蛋白-J的全长或部分片段的互补脱氧核糖核酸cDNA;
c、利用DNA重组技术将载脂蛋白-J cDNA全长或部分片段插入到一个质粒构成原核表达载体,通过基因重组将载脂蛋白-J连接一个标签多肽,该多肽由连续6组氨酸构成;
d、将此载脂蛋白-J表达质粒载体转染大肠杆菌,在抗菌素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增载脂蛋白-J表达质粒,抗菌素选为氨苄青霉素或/和氯霉素,在培养基中诱导重组载脂蛋白-J的合成;
e、收集转染的菌体,离心沉淀,裂解释放载脂蛋白-J,用制备层析方法分离载脂蛋白-J;
f、用Ni-NTA树脂从细菌中抽提含有连续6个组氨酸尾6HisTag的具有天然结构的可溶性重组载脂蛋白-J;
制备载脂蛋白-J表达菌体,包括在Luria Broth培养基下的表达菌体培养,离心收集菌体细胞,接着将收集的细胞重新混悬溶解于含有1%Triton X-100三硝基甲苯,500mM氯化钠,及10mM Tris-HCl,pH6.0,盐酸缓冲液中;
表达菌体进行处理时细胞被超声裂解,于Sarcosgl缓冲液10mM Tris-Hcl,pH8.0,150mM Nacl,1mM MgCl2,20mM依咪达唑imidagole,5mMβ-巯基乙醇,以及多种蛋白质抑制剂,在13000g离心后,5ml体积的上清液装置与Ni-NTA柱上,此柱用洗涤缓冲液10mM Tris-HCl,pH8.0,150mM Nacl,0.1%Triton X-10020mM依咪达唑,1mM MgCl2,5mM β-巯基乙醇平衡;
从载脂蛋白-J基因表达菌体抽提纯化载脂蛋白-J,用制备型SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳,用考马斯兰染色后可见到一个75kDa道尔顿的带与此融合蛋白相一致。
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