[发明专利]一种载脂蛋白－J的制备方法

权利要求书

1.一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于由以下工艺步骤组成：

a、采用脱氧核糖核酸DNA重组技术制备重组人或哺乳动物的载脂蛋白-J全长或部分片段并用亲和层析法纯化；

b、采用逆转录-多聚脱氧核糖核酸合成酶链反应RT-PCR技术从RNA克隆并扩增出载脂蛋白-J的全长或部分片段的互补脱氧核糖核酸cDNA；

c、利用DNA重组技术将载脂蛋白-J cDNA全长或部分片段插入到一个质粒构成原核表达载体，通过基因重组将载脂蛋白-J连接一个标签多肽，该多肽由连续6组氨酸构成；

d、将此载脂蛋白-J表达质粒载体转染大肠杆菌，在抗菌素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增载脂蛋白-J表达质粒，抗菌素选为氨苄青霉素或/和氯霉素，在培养基中诱导重组载脂蛋白-J的合成；

e、收集转染的菌体，离心沉淀，裂解释放载脂蛋白-J，用制备层析方法分离载脂蛋白-J；

f、用Ni-NTA树脂从细菌中抽提含有连续6个组氨酸尾6HisTag的具有天然结构的可溶性重组载脂蛋白-J；

制备载脂蛋白-J表达菌体，包括在Luria Broth培养基下的表达菌体培养，离心收集菌体细胞，接着将收集的细胞重新混悬溶解于含有1％Triton X-100三硝基甲苯，500mM氯化钠，及10mM Tris-HCl，pH6.0，盐酸缓冲液中；

表达菌体进行处理时细胞被超声裂解，于Sarcosgl缓冲液10mM Tris-Hcl，pH8.0，150mM Nacl，1mM MgCl₂，20mM依咪达唑imidagole，5mMβ-巯基乙醇，以及多种蛋白质抑制剂，在13000g离心后，5ml体积的上清液装置与Ni-NTA柱上，此柱用洗涤缓冲液10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM Nacl，0.1％Triton X-10020mM依咪达唑，1mM MgCl₂，5mM β-巯基乙醇平衡；

从载脂蛋白-J基因表达菌体抽提纯化载脂蛋白-J，用制备型SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳，用考马斯兰染色后可见到一个75kDa道尔顿的带与此融合蛋白相一致。