[发明专利]一种载脂蛋白－J的制备方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及生物医药工程技术领域，有关采用基因重组的制备方法，具体地说是一种载脂蛋白-J的制备方法。

[技术背景]

载脂蛋白-J(apolipoprotein-J)是一种硫基化的糖蛋白异二聚体，含有两条40KD的链，通过一种独特的5个二硫键相连，其多肽序列如图1所示。编码载脂蛋白-J的mRNA，从小鼠第14号染色体的单拷贝基因转录而来。有几个功能区域组成，如两亲螺旋，肝磷脂结合功能区，脂肪结合功能区等。这个蛋白最早是从公羊的睾丸网液体中分离，因为能够促进Sertoli细胞的凝集，支持精子的成熟和发展，所以命名为凝集因子(NCBI/Genbank，_NM.Sub.-203339，001831)。此后，不同物种的这一蛋白质被不同的研究机构分离和克隆。产生了很多的名字包括睾酮抑制前列腺信使2(TRPM-2)，硫化糖蛋白2(SGP-2)，载脂蛋白-J，SP-40，补体细胞溶解抑制剂(CTI)，二聚酸性糖蛋白(DAG)，gp80，NA1/NA2，糖蛋白III等等。很多的细胞和组织可以持续的表达低水平载脂蛋白-J。因此载脂蛋白-J存在于几乎所有的体液中，尤其是在组织间隙或上皮细胞的表面。在血液中载脂蛋白-J是高密度脂蛋白的一个蛋白成份，与载脂蛋白AI和对氧磷酶(paraoxonase，PON1，NM-000446)的功能相关。后者是一种重要的抗氧化的酶。载脂蛋白-J是一种高度诱导型蛋白，多种应激刺激因子或疾病可诱导载脂蛋白-J表达。例如在动脉硬化病人的病灶中的浓度很高。通常载脂蛋白-J含有一个长度为21个氨基酸的疏水或亲脂多肽基因。据报道，载脂蛋白-J的功能可能包括调控细胞凋亡，补体防御，脂肪再生，膜保护，维持细胞与细胞，细胞与基层组织之间的接触。可以有效地与脂质包括胆固醇、氧化固醇结合，促进胆固醇和氧化固醇从泡沫样细胞流出。这个蛋白还可以抑制补体介导的细胞死亡，促进细胞凝聚和黏附。最近，还发现载脂蛋白-J还是一种抗凋亡蛋白。据报道，在由于热休克和氧化疲劳引起的细胞中能诱导载脂蛋白-J的表达，抵抗细胞凋亡。在凋亡的组织中出现高水平的载脂蛋白-J。但是，经过对产生载脂蛋白-J的细胞的仔细分析，发现载脂蛋白-J的表达仅限于死细胞附近的活细胞，提示这个蛋白可能起到生存因子的作用，保护邻近的细胞。近来的一些研究也显示载脂蛋白-J是一种抗凋亡蛋白。然而，我们在利用载脂蛋白-J的生物活性功能时，必须寻找更好的方法提高它表达的合成存活率。

载脂蛋白-J指的是最早从公羊睾丸中分离的载脂蛋白J(NM-203339，NM-001831)，从其他哺乳动物中也分离到的该蛋白，有不同的命名。来自于不同动物的载脂蛋白-J的序列有不同的NCBI号码(NM013492，NM-053021，NM-012679)。产生的载脂蛋白-J可以诱导或引起编码乙醛脱氢酶、载脂蛋白-AI或对氧磷酶的基因的表达，这些是具有解毒能力的蛋白或酶。天然的或重组的全长或载脂蛋白-J片段在一种或多种细胞内发生，尤其是心肌细胞或血管细胞。由于载脂蛋白-J诱导产生的乙醛脱氢酶具有解毒的作用，可以清除氧化脂蛋白和氧化固醇引起的毒性，从而具有抗动脉硬化的作用。乙醛脱氢酶是由一些哺乳动物细胞如心肌细胞、血管细胞、未分化的干细胞中的核酸编码的。乙醛脱氢酶是一种异构体，重组的载脂蛋白-J表达发生在一种或多种哺乳动物组织中，(即心脏、血管、肝脏、肾脏、脑)，在一定程度上可以保护细胞免受氧化疲劳、缺血的损伤。

[发明内容]

本发明的目的在于提供一种产生或合成全长或部分载脂蛋白-J的方法。

为实现上述目的发明一种载脂蛋白-J的制备方法，其特征在于以下工艺步骤：

a、采用脱氧核糖核酸DNA重组技术制备重组人或哺乳动物的载脂蛋白-J全长或部分片段并用亲和层析法纯化；

b、采用逆转录-多聚脱氧核糖核酸合成酶链反应RT-PCR技术从RNA克隆并扩增出载脂蛋白-J的全长或部分片段的互补脱氧核糖核酸cDNA；

c、利用DNA重组技术将载脂蛋白-J cDNA全长或部分片段插入到一个质粒构成原核(如pET系列)或真核细胞(如pKS系列)表达载体，载脂蛋白-J cDNA连接或不连接于一个标签多肽基因；

d、将此载脂蛋白-J表达质粒载体转染大肠杆菌，在抗菌素选择培养基中培养此转染的细菌以扩增载脂蛋白-J表达质粒，根据质粒所含抗菌素阻抗基因，抗菌素可选为氨苄青霉素或/和氯霉素，在培养基中诱导重组载脂蛋白-J的合成；

e、收集转染的菌体，离心沉淀，裂解释放载脂蛋白-J，用制备层析方法分离载脂蛋白-J；