[发明专利]利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法。通过构建含pmi基因的植物表达载体，利用甘露糖作为选择剂、氯酚红法快速检测抗性植株获得转基因植物的方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗是一种高度杂合的无性繁殖作物，遗传背景非常复杂，一般表现为异源多倍体和多倍体的非整倍体，其染色体数目多，基因组巨大，在不同种间或同一种内的不同类型之间染色体数目差异很大，从2n＝54到2n＝128。甘蔗的栽培种大都来自热带种、割手密种和印度种等几个种的种间杂种，是带有广泛异质性和不配对染色体的混倍结合体，在细胞分裂过程中，染色体的异源配对、交换、分配等行为都具有特异之处，这给育种工作带来很大的盲目性，想要把亲本多个优良性状都结合起来非常困难(彭绍光，1990，甘蔗育种学，农业出版社)。所以要想通过常规的杂交育种方法和程序在优良品种中引入抗性基因时间长、效率低。转基因技术的日趋成熟在这方面开辟了一条全新的途径，对于甘蔗的遗传改良具有重要的意义。

以前，甘蔗的遗传转化主要还是通过基因枪转导或农杆菌介导法，利用抗生素如潮霉素、G418等进行筛选获得抗性植株，再经生物和分子(PCR、Southern和Northern杂交)检测确定转基因植株来实现的，综观国内外生物技术在改良甘蔗上的应用，转化后再生苗获得周期长、效率低，是制约其发展的主要问题。同时，目前在植物转基因上应用的筛选体系有很多种，根据其对转化体细胞新陈代谢活动的利弊，分为正向筛选体系和负向筛选体系。负向筛选体系使植物产生抗性的机理是它对抗生素类、除草剂类或其它类似物具有解毒作用，解除它们对植物细胞的毒性，从而使转基因植物细胞对抗生素等产生抗性，而非转基因的植物细胞对抗生素等敏感而被杀死。常用的负向筛选体系包括抗生素筛选体系和除草剂类筛选体系等。虽然这些负向筛选体系目前应用比较广泛，但也存在着不可忽视的缺陷，如：选择标记基因与目的基因无关，使用抗生素等物质对植物生长有负面影响，抗性标记基因有潜在的生态环境和食用安全性隐患等。在正向筛选体系中，转化细胞能利用筛选剂糖类作为主要碳源，可以在筛选培养基上生长，而非转化细胞不能利用筛选剂糖类，处于饥饿状态，生长受到抑制但不被杀死。近年来，与负向筛选体系相比，正向筛选体系在安全性方面具有优势，因此得到了快速发展。

甘露糖就是其中一种正向选择系统。D-甘露糖作为筛选剂的选择机理(Joersbo和Okkels.1996)是：D-甘露糖由植物细胞内源的己糖激酶催化转变为6-磷酸甘露糖，反应消耗ATP；pmi基因编码的磷酸甘露糖异构酶(PMI)再将6-磷酸甘露糖催化转变为植物细胞可代谢的6-磷酸果糖。在含D-甘露糖的筛选培养基上，转化细胞不断将甘露糖转变成6-磷酸果糖，但非转化细胞因缺乏PMI，不能继续代谢，造成细胞内6-磷酸甘露糖的积累，伴随着ATP和磷酸基的大量消耗，从而生长受到抑制；(Sheu-Hwa C S，Lewis D H，Wakler D A.Stimulation of photosynthetic starchformation by sequestration of cytoplamic orthophosphate.NewPhytol，1975，74：383-392)转化细胞则能将6-磷酸甘露糖转变为6-磷酸果糖，可继续代谢为细胞提供能量，同时避免了筛选剂衍生物6-磷酸甘露糖的积累，因此能在筛选培养基上利用甘露糖作为碳源进行生长和增殖。

发明内容

本发明的目的在于建立一种高效、快速获得转基因甘蔗的方法，从而实现甘蔗的高效基因工程育种，以便今后从多方面提高甘蔗品种的抗性和改善其品质。

本发明利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法，利用来自大肠杆菌中的pmi基因(GenBank：accession M15380)构建植物表达载体，建立了以甘露糖为筛选剂的转基因遗传转化筛选体系，并且建立了一整套快速、高效的转基因检测技术，大幅度提高了甘蔗转基因再生植株的获得率，为甘蔗的基因工程育种奠定了坚实的基础。

本发明利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法，包括以下步骤：

1、抗性植株的获得