[发明专利]一种灵芝脱氧核糖核酸酶及其提取纯化方法

权利要求书

1、一种灵芝脱氧核糖核酸酶，其特征在于

(1)分子量为13807Da；

(2)N-端的氨基酸序列为PLDTGRYHIY；

(3)具有QVETVVDRLDELPIR和ESPGLQGVSSVPLR两个肽段。

2、一种灵芝脱氧核糖核酸酶的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品前处理：鲜灵芝经冷冻干燥后粉碎，取冻干粉加入15倍体积的0.02moL·L^-1pH6.2的磷酸缓冲液，4℃浸提16h，然后离心12000×g，20min，获得上清液A；

(2)硫酸铵盐析：在上清液A中加入(NH₄)₂SO₄粉末，0℃条件下边加边搅拌至80％饱和度，待全部溶解后，4℃静置6h，12000×g，4℃离心20min，收集沉淀，并用蒸馏水透析除盐后再用0.02moL·L^-1pH7.5的Tris-HCl进行充分透析平衡，12000×g，4℃离心5min，得到溶液B；

(3)Blue-SepHarose 6 Fast Flow层析：将所述的溶液B，通过蠕动泵使流速为0.2mL/min；上到预先用0.02moL·L^-1 pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡好的亲和层析介质中；洗脱至A₂₈₀＜0.002，用含0～1moL·L^-1NaCl的0.02moL·L^-1 pH7.5的Tris-HCl梯度洗脱，洗脱体积为10倍的柱体积，流速为20-60mL/h，测定OD₂₈₀，收集洗脱峰；经PEG20000浓缩至1/5体积，然后再用0.02moL·L^-1pH5.8的磷酸缓冲液平衡，得到溶液C；

(4)SP Sephorose Fast Flow层析：将所述的溶液C加入用0.02moL·L^-1pH5.8的磷酸缓冲液平衡好的SP SephoroseFast Flow中，洗脱至A₂₈₀＜0.02；然后，以含0～0.3moL·L^-1NaCl的0.02moL·L^-1pH5.8的磷酸缓冲液梯度洗脱，洗脱体积为10倍的柱体积，流速40mL/h；测定OD₂₈₀，收集有酶活性的洗脱液，即洗脱液D；

(5)超滤浓缩所述洗脱液D至所需的酶活性。