[发明专利]一种灵芝脱氧核糖核酸酶及其提取纯化方法

说明书

所属技术领域  本发明涉及一种酶及其提取纯化方法，特别是一种灵芝脱氧核糖核酸酶及其提取纯化方法，属于生物化学领域。

背景技术

脱氧核糖核酸酶在核酸代谢过程和基础遗传机制中参与DNA复制、修复、重组及突变；控制基因表达，参与基因的置换、转座及重组；作为宿主系统中的重要组分，降解外源核酸分子，同时在免疫方面也具有重要作用。脱氧核糖核酸酶主要有2种：脱氧核糖核酸酶I，简称DNaseI；脱氧核糖核酸酶II，简称DNaseII。20世纪60年代末首先在牛胰腺中发现DNase I，随后在牛脾和胸腺中发现DNaseII。其中DNaseI是一种降解双链或单链DNA的核酸内切酶，产生带5′-磷酸末端的单核苷酸及寡核苷酸。其活性依赖二价金属阳离子，DNaseI的切割位点是随机分布。另外DNaseI也是一种重要的分子生物学工具酶，如可用于切口平移反应，体外转录模板DNA的分解去除等。

目前已经从多种生物中分离纯化了DNaseI。尤其是动物的脱DNaseI研究较为广泛和深入。根据报道已经分离纯化的DNaseI的分子量都在30-40KD，如人类DNaseI为38kD，牛DNaseI分子量为31kD，猪DNaseI为34kD。老鼠DNaseI为36kD；蛇DNaseI为40kD；鱼DNaseI为33kD。

目前用于分离脱氧核糖核酸酶的方法有多种。主要通过离子交换层析，疏水柱层析和亲和层析。分离介质有DEAE-Sepharose，Phenyl Sepharose，Sephadex G-75，Con Aagarose resins。其中较常用的Phenyl Sepharose为疏水柱层析。近年来，发展了一些新的分离介质用于脱氧核糖核酸酶的分离。例如采用DEAE cellulose，Double-stranded DNA cellulose和AF-Blue TOYOPEARL层析从Ccinereus.中分离纯化了一种新的脱氧核糖核酸酶；采用DEAE-cellulose，phenyl-Sepharose，Source 15Q从海星中分离了一种脱氧核糖核酸酶；采用concanavalin A和wheatgerm agglutinin两种凝集素混合制备的亲和层析柱一步法纯化了兔子、鼠等的脱氧核糖核酸酶I。

发明内容

本发明的目的是提供灵芝子实体中的一种脱氧核糖核酸酶及其提取纯化方法。该酶的提取纯化方法也可用于分离提纯其它食用菌、药用菌子实体中的脱氧核糖核酸酶。

本发明的一种灵芝脱氧核糖核酸酶的特征为：

1)采用美国ABI公司的MALDI-TOF，Voyager DE-STR测定，其精确分子量为13807Da。

2)将纯化的灵芝脱氧核糖核酸酶经电转印至PVDF膜上，采用Edman降解法，在美国ABI公司的Procise491型蛋白测序仪上测定，其N-端的氨基酸序列为PLDTGRYHIY。

3)用胰蛋白酶酶解后，采用美国ABI公司的4700串联飞行时间质谱仪质谱分析结果表明，具有QVETVVDRLDELPIR和ESPGLQGVSSVPLR两个肽段。

一种灵芝脱氧核糖核酸酶的提取纯化方法，以新鲜灵芝子实体为原料，经干燥处理后粉碎，保存备用；具体提取方法经粗酶抽提、(NH₄)₂SO₄盐析后，再由以下步骤完成：

1)Blue-SepHarose 6Fast Flow亲和层析，以含有0～1moL·L^-1NaCl梯度洗脱，流速为20-60mL/h；

2)SP Sephorose Fast Flow柱层析，以0～0.3MNaCl梯度洗脱，流速为20-40mL/h；

该灵芝脱氧核糖核酸酶是一种非限制性内切酶，可作用于超螺旋DNA，线状DNA，ssDNA和dsDNA，是一种非限制性内切酶。其酶活性依赖于二价金属阳离子Mg²⁺，10mmoL·L^-1EDTA可完全抑制其酶活性。最适pH值范围为pH7.5～pH9.0，在15℃条件下，就具有酶活性，可以将超螺旋DNA切割成环状DNA，并进一步切割成线状DNA形式。其活性随温度增高，酶活性增加，40℃时相对活性最高。在75℃条件下加热15min后完全丧失活性。灵芝脱氧核糖核酸酶水解DNA的产物末端的基团为3′-OH，5′-磷酸。

本发明的优点与积极效果：

1)首次从灵芝中分离纯化出一种新的脱氧核糖核酸酶，该方法具有快速提纯脱氧核糖核酸酶的特点，纯度高，能保持较高的酶活性。