[发明专利]从口腔组织中培养间质干细胞的方法

权利要求书

1.一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特生征在于包括下列步骤：

A、准备牙髓样本：将牙齿样本浸泡在缓冲溶液，或将牙齿样本冷藏保存，其保存时间小于或等于48小时，其后在牙齿表面预研磨出整圈的沟痕，其中沟痕的深度为0.5～1.0毫米，利用上述沟痕以外力剥开牙齿，暴露出牙髓组织，之后将牙髓样本抽出；

B、分离出牙髓间质干细胞：将牙髓样本浸泡在酵素混合液消化其它组织，之后加入培养基，并离心，离心后移除上清液，步骤B重复3至5次后，即得含牙髓间质干细胞的溶液；

C、细胞培养：将离心后的含牙髓间质干细胞的溶液悬浮于培养基，其中，该培养基含有3～5ml的5～20％胎牛血清，放入培养箱培养2至10天后，细胞即呈现牙髓间质干细胞型态。

2.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，该抽取牙髓样本的手术工具为根管锉、刮匙、镊子及探针之其中任一种。

3.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，该缓冲溶液为含抗生素杜比克氏磷酸缓冲溶液，所含的抗生素系为青霉素及链霉素。

4.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，利用外力剥开牙齿，暴露出牙髓组织的方式是以齿科工具，在沟痕位置加以切割、槌击、施压或研磨之其中任一种方式。

5.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤B，该酵素混合液包括第一型胶原蛋白酶与分解酶，且该酵素混合液须在37℃水浴进行消化作用。

6.如权利要求1所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于上述细胞培养后进行后续保存：

牙髓间质干细胞培养至70％生长浓度后，加以收集，其中牙髓间质干细胞收集方法为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸盐，将收集的牙髓间质干细胞加入培养基混合后离心，离心移除上清液后，加入冷冻保护剂，其中该冷冻保护剂组成系包括：培养基、胎牛血清、5-15％二甲基亚砜，之后将牙髓间质干细胞及冷冻保护剂的混合物暂时储存于梯度降温冷冻盒，冷冻5～24小时后，其中该梯度降温冷冻盒须每分钟降1℃，降至特定温度，再转放至液态氮储存。

7.如权利要求6所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于上述后续保存后进行解冻培养：

将牙髓间质干细胞从液态氮中取出，置于水浴中解冻，其后离心移除上清液后，将培养基加入解冻的牙髓间质干细胞，在培养箱培养2至5天，其中，将培养基加入时，需一滴一滴的依序加入至所需份量。

8.如权利要求6或7所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于：所使用的培养基含5～20％的胎牛血清。

9.一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于包括下列步骤：

A、准备牙龈粘膜样本：将牙龈粘膜组织浸泡在缓冲溶液后，或将牙龈粘膜组织冷藏保存，其保存时间小于或等于48小时，再利用切割或打孔方式采集牙龈粘膜样本；

B、分离出牙龈粘膜间质干细胞：将牙龈粘膜样本浸泡于酵素混合液消化其它组织，之后加入培养基，并离心，离心后移除上清液，步骤B重复3至5次后，即得含牙龈粘膜间质干细胞的溶液；

C、细胞培养：将离心后的含牙龈粘膜间质干细胞的溶液悬浮于培养基，其中，该培养基含有3～5ml的5～20％胎牛血清，放入培养箱培养2至10天后，细胞即呈现牙龈粘膜间质干细胞型态。

10.如权利要求9所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，该切割方式为手术刀切割或电刀切割。

11.如权利要求9所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤A，该缓冲溶液为含抗生素杜比克氏磷酸缓冲溶液，该所含的抗生素系为青霉素及链霉素。

12.如权利要求9所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于步骤B，该酵素混合液包括第一型胶原蛋白酶与分解酶，且该酵素混合液须在水浴下进行消化作用。

13.如权利要求9所述之从口腔组织中培养间质干细胞的方法，其特征在于：该水浴的温度为37℃。