[发明专利]从口腔组织中培养间质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，是由牙齿的牙髓组织中分离出牙髓间质干细胞或由牙龈粘膜组织中分离出间质干细胞并进行培养。

背景技术

间质干细胞与胚胎干细胞为两大主流干细胞种类，常被运用在细胞或疾病治疗研究方面，间质干细胞可从多种不同的组织中被分离出来，包括骨髓、肝脏、血管及神经组织。其中常被研究的组织，莫过于来自骨髓的间质干细胞，这种来自骨髓的间质干细胞具有自我更新再生能力，也能分化成多种不同的细胞来源，近年来文献指出，来自骨髓的间质干细胞可在老鼠中改善脑部的神经生长(PNAS2005；102(50)，18171-18176)，或是增加胰岛素的产量(PNAS 2006；103，17438-17443)，这都是间质干细胞在治疗上的研究方向。

近年来，在哺乳类动物口腔组织间质干细胞研究中，发现哺乳类动物牙髓间质干细胞及牙龈粘膜间质干细胞绝大部分特征表现与骨髓的间质干细胞相近，例如：拥有自我更新再生能力，也具有可以分化为脂肪与骨质的能力(PNAS 2000；97(25)，13625-13630)(JDent Res 2002；81(8)，531-535)。然而，这些研究仅局限于第三大臼齿及乳门牙，且前述研究方式需要把牙齿由牙骨质与珐琅质接合处作整颗牙齿横切断开，十分耗时，同时牙髓组织容易被污染。

由于人们在不同口腔牙周疾病或治疗情况下，或是人为与非人为因素而脱落或替换牙齿，都有可能导致需要拔掉牙齿或切除牙龈粘膜组织，  因此本发明提供一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从口腔组织中培养间质干细胞的方法，以降低污染机会，且使间质干细胞易于培养与保存，分离出的间质干细胞具有群集能力、分化为骨质能力、分化为脂肪能力及分化为神经能力。

本发明的解决方案一包括下列步骤：

A、准备牙髓样本：将牙齿样本浸泡在缓冲溶液，或将牙齿样本冷藏保存，其保存时间小于或等于48小时，其后在牙齿表面预研磨出整圈的沟痕，其中沟痕的深度为0.5～1.0毫米，利用上述沟痕以外力剥开牙齿，暴露出牙髓组织，之后将牙髓样本抽出；

B、分离出牙髓间质干细胞：将牙髓样本浸泡在酵素混合液消化其它组织，之后加入培养基，并离心，离心后移除上清液，步骤B重复3至5次后，  即得含牙髓间质干细胞的溶液；

C、细胞培养：将离心后之含牙髓间质干细胞之溶液悬浮于培养基，其中，该培养基含有3～5ml之5～20％胎牛血清，放入培养箱培养2至10天后，细胞即呈现牙髓间质干细胞型态。

上述步骤A，该抽取牙髓样本的手术工具为根管锉、刮匙、镊子及探针之其中任一种。

上述步骤A，该缓冲溶液为含抗生素杜比克氏磷酸缓冲溶液(DPBS，Dulbecco’s phosphate buffersaline)，其所含的抗生素为青霉素及链霉素。

上述步骤A，暴露出牙髓组织的方式是以齿科工具在沟痕位置加以切割、搥击、施压或研磨之其中任一种方式进行。

上述步骤B，该酵素混合液系包括第一型胶原蛋白酶(Collagenase Typel)与分解酶(Dispase)，且该酵素混合液须在37℃水浴进行消化作用。

上述A～C步骤所分离及培养出的牙髓间质干细胞进行后续保存及解冻培养：

牙髓间质干细胞培养至70％生长浓度(confluence)后，加以收集，其中牙髓间质干细胞收集方法为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸盐(Trypsin-EDTA)，将收集之牙髓间质干细胞加入培养基混合后离心，离心移除上清液后，加入冷冻保护剂，其中该冷冻保护剂组成系包括：培养基、胎牛血清、5-15％二甲基亚砜(DMSO，Dimethylsulfoxide)，之后将牙髓间质干细胞及冷冻保护剂之混合物暂时储存于梯度降温冷冻盒，冷冻5～24小时后，其中该梯度降温冷冻盒须每分钟降1℃，降至特定温度，再转放至液态氮储存。

解冻培养时，将牙髓间质干细胞从液态氮中取出，置于37℃温度的水浴中，使其快速解冻，离心后移除上清液后，将培养基加入解冻的牙髓间质干细胞，在培养箱培养2至5天，其中，将培养基加入时，需一滴一滴的依序加入至所需份量。

上述细胞保存及解冻培养所使用之培养基含5～20％的胎牛血清。

本发明的解决方案二包括下列步骤：

A、准备牙龈粘膜样本：将牙龈粘膜组织浸泡于缓冲溶液后，将牙龈粘膜组织冷藏保存，其保存时间小于或等于48小时，再利用切割或打孔方式采集牙龈粘膜样本。