[发明专利]一种蛇毒抗肿瘤侵袭与转移的解离素

权利要求书

1.一种短尾蝮蛇毒解离素的分离，其特征是：将粗毒先经Superdex 75凝胶过滤色谱去除大分子组分，得到含解离素的主要蛋白峰；再用弱阴离子DEAEsepharose作为介质、三羟甲基氨基甲烷缓冲液作为洗脱液分离等电点不同，分子量相近的蛋白，最后以Lichrospher C18反相层析去除等电点相近疏水性不同的成分，从而纯化解离素，获得纯品。

2.根据权利要求1所述的一种短尾蝮蛇毒解离素的分离，其特征是：所述的缓冲液pH为pH＝8.5，盐浓度达0.05mol.L^-1，此时解离素组分全部被洗脱，收集的组分可直接进行生化及药理活性的测定。

3.解离素的纯化，其特征是：将权利要求1得到的解离素应用凝胶过滤，再经离子交换色谱所得的活性组分，并非是单一蛋白的组分，它是分子量和等电点相近的蛋白质或多肽的混合物；对于蝮科蛇毒，可抑制ADP诱导的血小板聚集的除解离素外还有磷脂酶A₂(PLA₂)；对于混有PLA₂的解离素组分，依据解离素与PLA₂的疏水性有较大差异：解离素疏水性小于PLA₂，选用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，在C18柱上用乙腈梯度洗脱将它们分离。应用RP-HPLC除了能去除解离素组分中的PLA₂外，由于RP-HPLC纯化得到的蛋白质可以通过冻干去除有机溶剂(乙腈)和离子对试剂(三氟乙酸)而得到蛋白质纯品，与离子交换层析的纯化产物需要透析、浓缩相比，大大缩短了实验时间，减少了样品失活的可能性；解离素含4～8对二硫键，性质十分稳定，即使在高浓度的有机溶剂中也不致失活，这都是采用RP-HPLC纯化解离素的依据所在。

4.根据权利要求3所述的解离素的纯化其特征是：所述的RP-HPLC精细纯化解离素组分时，有两个洗脱峰具有血小板聚集抑制活性，分别对应于乙腈浓度23％和40％，经滴定法检测洗脱峰的PLA₂活力、电泳测定分子量大小及抑制血小板聚集活性的强弱，判定两个洗脱峰中的后者是PLA₂，前者为不含PLA₂的解离素纯品，去除了混杂的PLA₂。

5.一种短尾蝮蛇毒解离素，其特征是：采用Superdex 75、DEAE SepharoseFast Flow离子交换层析、Li chrospher C18反相层析从短尾蝮蛇蛇毒粗毒中分离得到了一个解离素纯品GbvIV4其氨基酸序列为：

1   GEECDCGSPG NPCCDAATCK  LRQGAQCAWG  LCCDQCRIMK

41  KGTVCRIARG  DDMDCYYNGIS  AGCPRNNF_*。