[发明专利]一种蛇毒抗肿瘤侵袭与转移的解离素

说明书

技术领域

本发明涉及生化与生物医药领域，具体的说是一种蛇毒抗肿瘤侵袭与转移的解离素。

背景技术

整合素是普遍存在于细胞中的一种跨膜糖蛋白，广泛参与体内的生理和病理过程，其拮抗剂在抗血小板聚集、抗肿瘤以及抗肿瘤转移中展示出良好的应用前景，是药物开发的一个重要方向。根据阻断受体的作用机制不同，整合素拮抗剂可分为以下两类：(1)抗整合素单克隆抗体如GPIIb/IIIa受体人-鼠嵌合单克隆抗体阿西单抗(Abciximab，c7E3)，已获美国FDA批准用于临床，是目前最成功的抗血小板药物。(2)能够封闭整合素结合位点的拮抗剂包括来源于天然生物毒素的解离素(disintegrin)以及以合成多肽和肽类衍生物等。解离素是主要从蛇毒中分离的能够阻断整合素与其配体结合的一类富含半胱氨酸的小分子多肽，含有精-甘-天冬氨酸(Arg-Gluy-Asp，RGD)、赖-甘-天冬氨酸(Lys-Gluy-Asp，KGD)等序列。RGD序列是ECM及其基底膜中的纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白、骨桥蛋白和血管性假血友病因子等所含有的高度保守的氨基酸序列，其与肿瘤细胞、新生血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞表面以及血小板等表面的整合素结合，参与肿瘤细胞的侵润过程。含有RGD序列的解离素可以竞争性地与上述整合素配体结合，干扰肿瘤细胞-ECM或其他细胞间的相互作用，从而抑制血小板聚集形成瘤栓、肿瘤血管新生，达到抑制肿瘤细胞侵润、转移的目的。

蛇毒是多种酶或非酶蛋白质或多肽的混合物，含有多种分子量不等，等电点各异的蛋白质或多肽分子。分离蛇毒中活性成分有多种层析方法：根据分子量差异分离蛋白的凝胶过滤层析法，根据等电点差异分离蛋白的离子交换层析法，以及根据疏水性差异分离蛋白的疏水层析和反相层析法等。

现有的80余种解离素中，有41种报道有抑制血小板聚集的作用，其中35种解离素的氨基酸序列中含有RGD序列，可见解离素分子活性中心的RGD三肽活性基元对维持抑制血小板聚集的活性是必须的。解离素的分子结构特征是在多肽分子中含有能与整合素结合的三基肽，如RGD、KGD、MLD(蛋氨酸-亮氨酸-天冬氨酸，Met-Leu-Asp)和KTS(赖氨酸-苏氨酸-天冬氨酸，Lys-Thr-Ser)等，同时含有一定数量的二硫键。根据分子大小和二硫键数目分为4类：(1)短链解离素(41-51个氨基酸，4对二硫键)；(2)中链解离素(约70个氨基酸，6对二硫键)；(3)长链解离素(83个氨基酸，7对二硫键)；(4)双链解离素(同双链和异双链)。目前已发现的解离素大部分为中链解离素。

发明内容

本发明的目的是要提供一种应用色谱技术从短尾蝮蛇蛇毒(Gloydiusbrevicaudus venom，GBV)中分离纯化出具有抑制肿瘤血管生成，抗肿瘤侵袭、转移等作用的中链解离素(解离素蛋白)；及其抗肿瘤侵袭、转移和肿瘤血管生成作用和制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

1、短尾蝮蛇毒解离素的分离：将粗毒先经Superdex 75凝胶过滤色谱去除大分子组分，得到含解离素的主要蛋白峰；再用等电点差异分离蛋白的离子交换层析法进一步分离；采用弱阴离子DEAE sepharose作为介质、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液作为洗脱液，使带负电荷的解离素与色谱柱上正电荷基团结合，再通过增加离子强度使带负电荷的无机离子置换结合在色谱柱上的解离素，即获得分离。所述的缓冲液pH为pH＝8.5，盐浓度达0.05mol.L^-1，此时解离素组分全部被洗脱，收集的组分可直接进行生化及药理活性的测定。

2、解离素的纯化：