[发明专利]一种以翡翠贻贝粘附蛋白制备生物粘合剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物粘合剂，尤其是涉及一种从翡翠贻贝提取粘附蛋白制备防水生物粘合剂的方法。

背景技术

海洋贻贝属于软体动物门瓣鳃纲，是沿岸和近海中普遍存在的一种生物，其足丝腺能分泌足丝附着在坚硬的基体上，使它们能在巨浪冲刷下仍紧紧附着于礁石而不分离。这种足丝粘胶的主要成分足丝粘附蛋白具有高强度、高韧性和防水性。目前已有美国BD Bioscience公司从紫贻贝(Mytilus edulis)的足部提取到粘附蛋白，用作细胞和组织粘附剂，该产品已商业化，名称和货号分别为BD CELL-TAK^TM CELL AND TISSUE ADHESIVE，Catalog No.354240，354241。该产品可涂覆用于细胞培养和组织切片等的玻片、塑料或金属表面以增强与样品的粘附。但紫贻贝分泌粘附蛋白的量极少，从大约10000个贻贝中也仅能提取到1mg的粘附蛋白，因此由此获得的粘附蛋白产品CELL-TAK^TM价格十分昂贵，很难满足需要。

已有文献报道用基因工程手段表达重组的粘附蛋白用作生物粘合剂，他们用原核表达载体pTrcHisA重组紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)的Mgfp-3A、Mgfp-5以及Mgfp-5与Mgfp-1的十肽重复序列融合蛋白，结果表明表达的重组蛋白具有较好的粘附功能(1、Hwang DS，GimY，Cha HJ.Expression of functional recombinant mussel adhesive protein type 3A in Escherichiacoli[J].Biotechnol Prog，2005，21(3)：965-970；2、Hwang DS，Gim Y，Kang DG，et al.Recombinant mussel adhesive protein Mgfp-5 as cell adhesion biomaterial[J].J Biotechnology，2007，127(4)：727-735；3、Hwang DS，Gim Y，Yoo HJ，et al.Practical recombinant hybrid musselbioadhesive fp-151[J].Biomaterials，2007，28(24)：3560-3568)

发明内容

本发明的目的在于提供一种从原料来源广泛、价格低廉的翡翠贻贝(P.viridis)中提取粘附蛋白，低成本制备具有良好生物相容性的防水生物粘合剂的方法。

本发明的具体步骤如下：

1.取活的翡翠贻贝足部，用—5～0℃的PBS冲洗后，在—5～0℃的含蛋白酶抑制剂的5％醋酸溶液中切碎，得切碎混合液；

2.用分散机/均质器将上述切碎混合液在冰上匀浆，得组织匀浆液；

3.将组织匀浆液离心，取上清S1，记录体积V1，弃沉淀；

4.将上清S1冰浴，加入60％高氯酸(PCA)至终浓度为1％；

5.温和搅拌20～40min后离心，回收上清S2，记录体积V2；

6.将上清S2在-10～-20℃的冰乙醇中冷却，搅拌时加入浓硫酸酸化，至终浓度为0.3M；

7.向混合液中加入两倍体积的预冷的-82～-86℃丙酮；

8.静置20～30min后离心，弃上清，取沉淀溶于5％乙酸中，再离心，取上清液，冻干；

9.用5％冰醋酸溶液重新溶解冻干产物，离心去沉淀，将上清浓度调整到蛋白浓度为1.44mg/ml，即得到一种以翡翠贻贝粘附蛋白制备生物粘合剂(Pvfp)。

所述的蛋白酶抑制剂为胃酶抑素A、亮肽酶素或苯甲基磺酸氟(PMSF)。

本发明通过从盛产于我国东南沿海的翡翠贻贝中快速获得粘附蛋白防水生物粘合剂。用该方法制备的翡翠贻贝生物粘合剂具有产量高，成本低廉，粘附效果好等特点。在制备过程中，仅在提取初期需要微量的胃酶抑素A、亮肽酶素和PMSF，其余的试剂均为常规化学试剂，配制方便，价格低廉，制备操作便捷。所制备的粘附蛋白防水生物粘合剂能在潮湿的环境下粘附在玻璃、金属钛、塑料表面并且流水冲洗2h也不掉，能在短时间内粘附细胞，与CELL-TAK^TM细胞和组织粘附剂相比有更好的效果，没有发现细胞毒性。在潮湿的环境下，几微克的微量粘附蛋白防水生物粘合剂就能粘接塑料和小鼠股骨。所得防水粘合剂作为生物医用材料生物粘合剂在临床使用具有广泛的应用前景。

附图说明