[发明专利]一种检测土壤中铵氧化酶活性的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及土壤中铵氧化酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中铵氧化酶活性的分析方法。

背景技术

土壤中的铵氧化酶能将在土壤氮代谢过程中形成的铵态氮氧化成亚硝态氮，在其它酶的作用下进一步氧化成硝态氮，引起氮素的损失，降低氮素的利用效率。

因此，土壤中铵氧化酶活性的强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素损失的大小，间接影响氮肥的利用效率。土壤中铵氧化酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中铵氧化酶活性的检验有很重要的意义。而到目前为止，有关铵氧化酶活性的测定没有形成一个可靠的方法，只是以其它酶的测定方法为基础进行类似测定，这样就造成了不同培养批次的差异性和不确定性，使其难以适应土壤中铵氧化酶活性的定性比较和定量研究，降低了实验效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种土壤中铵氧化酶活性的检测方法；该方法是在借鉴其它酶测定方法的原理基础上，根据铵氧化酶的特性，对其它酶活性的测定步骤和显色方法进行改进，形成了适合测定铵氧化酶活性的方法，该方法减少了试验步骤的复杂性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测土壤中铵氧化酶活性的分析方法，

1)称取5-10g鲜土样品n份分别置入n个三角瓶中，n≥2，向其中n-1个三角瓶中加入5-15mL 1-10mM的底物硫酸铵工作液，另1支试管中加入等量的蒸馏水代替底物作为样本对照，然后向所有三角瓶中加入0.2-0.5mL1.0-2.0M的氯酸钠溶液(试验中加入的氯酸钠溶液是用来抑制亚硝态氮到硝态氮的氧化)，混匀，盖好瓶塞，放在37±1℃恒温培养中恒温培养2±0.2h；同时作试剂空白对照；

2)培养结束后，分别向三角瓶中加入5-20mL 1.8-2moLKCL溶液，混匀，振荡1±0.5h后，过滤；

3)分别吸取5-10ml滤液于比色试管中，加入3-5ml 0.19M-0.2M氯化铵缓冲溶液和2-5ml显色剂，混匀，显色15±5min；

4)用分光光度法520nm处测定吸光度A；

5)制作工作标准曲线：配制一系列亚硝态氮标准溶液，分别吸取一系列的标准溶液5-10ml于不同比色试管中，分别加入3-5ml 0.19-0.2M氯化铵缓冲溶液和2-5ml显色剂，混匀，显色15±5min，与样品一起在520nm测定吸光度A’；以亚硝态氮溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；

6)根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中亚硝态氮的浓度S，S＝A*b；

7)计算样品中亚硝态氮含量；

8)计算铵氧化酶活性：

计算公式为：(S-C)*V₁*V₂/(V₃.W)＝μg NO₂-N/g干土.2h

式中：S为样品测定的平均值(mg NO₂-N/L)；C为对照值(mgNO₂-N/L)；V₁为比色试管中的液体体积(mL)；V₂为提取液的体积(mL)；V₃为吸取的滤液体积(mL)；W为干土质量(g)。

所述制作工作标准曲线过程为，吸取1000mg NO₂-N/L的亚硝态氮标准贮备液5mL，定容到500mL，此为10mg NO₂-N/L的溶液；再分别吸取该液0，2，4，8，10mL于100mL容量瓶中，加入5-15mL 1.8-2M KCI溶液后，用蒸馏水定容，如有沉淀过滤；此标准系列含亚硝态氮的量分别为0，0.2，0.4，0.8和1.0mg NO₂-N/L；分别吸取一系列的标准溶液5-10ml于不同比色试管中，加入3-5ml 0.19-0.2M氯化铵缓冲溶液和2-5ml显色剂，混匀，显色15±₅min，与样品一起在520nm测定吸光度A’；以亚硝态氮溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b。

所述实验所使用的蒸馏水，使用前，需将其加热至沸腾驱除水中的O₂，然后封闭冷却至室温；显色剂磺胺和N-(1-奈基)-乙二胺盐酸溶液必须为无色且是当天配制的，而它们的加入相对于亚硝酸根为过量的；

本发明方法改进的依据