[发明专利]微生物发酵生产1,3－丙二醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种利用单一微生物将可发酵的甘油碳源生物转化为1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇(1，3-propanediol，简称1，3-PDO)是重要的化工和医药中间体原料，是一种在生产聚酯纤维中和在制造聚亚胺酯及环状化合物中具有潜在应用价值的单体。

目前工业上主要采取化学合成法来进行1，3-丙二醇的生产。已经知道有很多种化学途径能够生产1，3-丙二醇，但化学法副产物多，产品分离提纯较困难，生产成本相应较高。相比之下，生物转化法生产1，3-丙二醇以其利用再生资源、对环境污染小等特点越来越受到重视。

目前生产1，3-丙二醇的微生物法大致可分为三类：一是用肠道细菌将甘油歧化为1，3-丙二醇(USP5254467和EP0373230A1)；二是以葡萄糖为底物用基因工程菌生产1，3-丙二醇(PCT/US 96/-6705、USP5599689、WO 96/35796、WO9821340及WO 9821339)；三是将生产甘油和1，3-丙二醇的两株菌混合培养(USP5599689)。这些方法各有优缺点：第一种方法的转化率和产物浓度均较高，但是甘油价格偏高，影响1，3-丙二醇的生产成本；第二种方法可以降低原料成本，但基因工程菌的生产能力及其稳定性还不太理想；第三种方法有助于减少两步发酵的时间，但由于两种菌的生长条件不尽相同，如产甘油菌通常在好氧条件下生长，而产1，3-丙二醇菌通常在厌氧条件下生长，因此很难取得较为理想的效果。

就目前情况来看，甘油转化1，3-丙二醇的技术最为成熟，效果也最好。比较理想的方法是利用甘油做底物，以克雷伯氏菌(Klebsieblla penumoniae)、非氏柠檬酸菌(Citrobacter freandii)或丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)等厌氧或兼性厌氧菌为发酵菌种(这些菌种已经解决了底物和产物高浓度耐受能力差的问题)。发酵菌种利用甘油进行厌氧或兼性厌氧代谢生产1，3-丙二醇都是通过氧化和还原两个支路进行的，两个支路间通过生物体的能荷(由ATP提供)与氢荷(由NADH₂提供)维持代谢通量分布。

其氧化途径的主要步骤为：(1)甘油经甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase，GDH)催化生成2-羟基丙酮(DHA)，该酶为厌氧酶，以NAD⁺为辅酶，受到体系的氢荷水平的影响；(2)DHA在ATP及2-羟基丙酮激酶(Dihydroxyacetonekinase)的作用下，生成磷酸二羟丙酮(DHAP)；(3)DHAP进一步代谢生产丙酮酸。丙酮酸是代谢过程中很重要的中间产物，它进一步代谢为各种小分子产物，如乙酸、乳酸、乙醇、甲醇等，同时产生菌体生长和生产所必需的NADH₂和ATP，这些小分子副产物再进行厌氧发酵。

随着发酵的进行，有机酸等副产物的累积极大地影响了菌体生长与生产的能力。尤其是乙酸和乳酸等有机酸副产物，不仅使得发酵液pH值降低，而且它们在体系的存在严重抑制了氧化途径的代谢过程，不利于甘油歧化过程两个支路之间的平衡与协调。一般解决办法是及时分离产出有机酸或将其转化为有机酸盐的形式加以转化回收。由于PDO发酵生产中在线除去有机酸存在较大难度，因此发酵过程中采取加入氢氧化钾或氢氧化钠中和发酵副产物以促使发酵进行的方法，而在发酵结束后，通常采用电渗析法分离有机酸盐完成发酵液的脱盐。在CN1763210A中通过加入3-5M的氢氧化钠溶液来中和发酵过程生成的有机酸，发酵液通过常规方法脱盐。徐友海等在《不同甘油原料发酵生产1，3-丙二醇的研究中》(精细与专用化学品Vol 14 No.5 P14-17)中用5M的氢氧化钠溶液调控pH值。《膜科学与技术》Vol 25 No.4 P21-29通过加入氢氧化钾实现对发酵体系的pH值控制，并通过电渗析进行脱盐。

上述各种方法虽然都能实现对发酵过程pH值的控制，但不能很好地提高发酵效率。各种文献资料表明，利用碱性钙盐对发酵过程中体系的PH进行控制，进行有效代谢还未有报道。

发明内容