[发明专利]微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺

权利要求书

1、一种微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺，其特征在于：生产工艺为：

(1)发酵：委内瑞拉链霉菌秦岭变种经过摇瓶发酵生产得发酵液；

(2)提取；发酵液通过预处理、过滤、减压浓缩、离心、沉淀、干燥、阳离子交换吸附、洗脱、减压浓缩干燥制得瑞拉菌素粗品；

(3)精制：粗品经纯化溶解、大孔树脂柱层析、反相制备分离、浓缩干燥制得成品。

2、根据权利要求1所述的微生物发酵法生产瑞拉菌素的生产工艺，其特征在于：

(1)发酵：

①菌种培养：

a：菌种培养基：放线菌分离培养用培养基：高氏一号培养基；真菌培养及颉抗试验用培养基：PDA；

b：将配置好的分离培养用培养基NaCl调节PH7.0，装于斜面试管和三角瓶，在0.105Mpa蒸气压力灭菌30分钟，自然冷却至45℃，三角瓶中培养基用于菌种的分离、筛选。斜面试管倾斜45°摊平，待凝固放置30°培养箱培养，48小时后无菌条件下接种纯化或筛选的菌株，在30°培养箱培养36-86h，放置冰箱4℃保管；

c：取筛选出的丰满无杂菌的最优拮抗菌株36-72h培养皿内培养菌种，刮下菌体，接种于发酵液中；

(2)发酵培养：

培养成熟的菌株接种于发酵瓶，在适宜条件下，菌体发酵代谢产生活性物质；

a：发酵培养基：发酵培养基配方：黄豆饼粉2％，葡萄糖1％，淀粉1.5％，碳酸钙0.25％，磷酸氢二钾0.05％；

b：根据发酵培养基配方配制发酵培养基，将配制好的培养基等量加入多个发酵瓶中，经发酵条件的优化得出摇床转速在150r/min，30-34℃摇瓶培养72h活性物质充分产生；

(3)发酵液预处理：

发酵到时后，用1mol/l草酸调PH到4，静置0.5h后再调PH至4.0，再静置半小时后过滤，收集滤液；

(4)粗提：

a：滤液在旋转薄膜蒸发器中70℃减压浓缩至小体积，用6mol/L的NaOH调PH至7.0，5000rpm离心30min，弃沉淀，取上清液。上清液用10倍体积的冰冻丙酮沉淀，弃上清液，取沉淀，干燥；

b：732阳离子交换树脂吸附：

732阳离子树脂用水浸泡2h后，减压抽去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2mol/l的HCl，搅拌4h，除去酸液，水洗至中性，再加4倍量2mol/L NaOH，搅拌4h，除去碱液，水洗至中性，用4倍量的2mol/LNaOH浸泡2h，转为Na+型装柱，将丙酮沉淀用重蒸水充分溶解，加样，用蒸馏水冲洗至流出液无色、澄清，然后用3％氨水洗脱，分段收集洗脱液。用孢子萌发法检测各段洗脱液的活性。活性部分减压浓缩得粗提物；

(5)精提：

a：大孔树脂柱层析：

新树脂先用无水乙醇浸泡3-4d后，装入层析柱，用无水乙醇冲洗大孔树脂，放置6h，待大孔吸附树脂沉降紧实后，以6倍柱体积的蒸馏水冲洗柱体，然后用3-4倍体积的2％HCl溶液冲洗树脂并浸泡2-4h，再用蒸馏水洗至出水为PH呈中性，用3-4倍体积的2％NaOH溶液冲洗树脂，并浸泡2-4h，而后用蒸馏水洗至出水为PH呈中性，将离子交换树脂提取的活性洗脱液静态吸附到大孔树脂上，分别用蒸馏水、40％乙醇、60％乙醇、100％乙醇作为洗脱剂，洗脱液每管收集20ml，减压浓缩，用孢子萌发法测活，将活性洗脱液干燥，得精提物；

b：在反相制备柱高效液相色谱上对精提物进一步切割分离，制备色谱各峰用孢子萌发法测活性，对抑菌效果强的单组分进行分离制备，并对其进行理化性质和结构分析。