[发明专利]通用型基因打靶载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，设计一种基因打靶载体，特别是一种用于生产转基因动物过程中的通用型基因打靶载体的构建方法。

背景技术

转基因动物生产研究在现代家畜育种，动物疾病模型研究及基因功能研究等领域都有重要意义。自1985年Hammer等用原核注射法生产转基因兔以来，原核注射法一直是生产转基因动物的主要方法，但原核注射法存在只能对胚胎发育早期细胞进行操作，整合效率低，多拷贝随机插入等问题。在原核注射法出现的同时对胚胎干细胞进行遗传修饰的技术也发展起来，并且生产了一些转基因动物，但大家畜的胚胎干细胞迄今尚未建系。1997年克隆羊多莉的诞生使以体细胞为遗传操作单位的转基因动物生产成为现实。基因工程技术结合核移植技术生产转基因动物方法已经成为生产转基因动物的主要方法，国内外报道用这种方法已经生产了转基因牛，转基因羊等动物。

结合核移植技术生产转基因动物中，国内外学者应用了腺病毒载体法、腺病毒相关病毒载体法、慢病毒载体法、普通质粒载体法等一系列的方法对核移植供体细胞进行遗产操作并且已经生产出了多种转基因动物。但由于基因表达调控本身的复杂性以及这些方法介导的外源基因在动物基因组中整合的随机性，使得外源基因在宿主动物体内的表达水平大多停留在一个较低水平，且个体间表达水平差异很大。基因打靶技术是一种定向改变细胞或生物个体遗传信息的实验手段，通过外源基因与基因组基因同源重组对细胞进行单拷贝基因定位修饰技术，因此可以克服随机整合的问题，自1987年首次报道用基因打靶技术对小鼠ES细胞进行遗传修饰以来，迄今为止用基因打靶方法已经生产出了多种转基因动物。

基因打靶也称为基因定点同源重组，是指通过外源DNA与染色体DNA同源序列之间的重组来改造基因组特定位点，从而改变生物遗传特性的方法。通过基因打靶可以纠正染色体特定位点上的自发突变，恢复细胞正常的生理功能；也可以把理想突变引入到基因组的某一位点，使之稳定地遗传下去。基因打靶的概念是20世纪70年代初在酵母研究中发展起来的，直到1985年Smithies等才首次报道在肿瘤细胞中实现人工打靶载体和内源β球蛋白基因间的同源重组，1987年Smithies和Capecchi的研究小组在小鼠胚胎干细胞实现了定位剔除，现在基因打靶技术在生命科学的多个领域都有应用。随着基因打靶技术的发展，已经出现了多种类型的基因打靶载体，大多基因打靶载体的构建是在Mansour等设计的一种称为正负筛选系统发展起来的，正选基因与同源臂一起整合入基因组中通过药物筛选确定整合细胞，负选基因用于排除随机整合的细胞进一步富积中靶细胞，正选基因一般选择新霉素抗性基因(neo)，负选基因一般选择疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk)。

基因打靶技术的关键是打靶载体的构建，已公开的专利申请中有许多基因打靶载体的构建，但都是某个基因位点的打靶载体，不同打靶位点分别构建基因打靶载体势必增加工作量及实验经费。基因打靶载体中的正选基因在筛选整合进细胞的同时一起随同源臂进入基因组中，正选基因的进入必将影响转基因动物个体的生理状况，从而影响该技术在生产中的应用。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种通用型基因打靶载体的构建方法。

为了实现上述任务，本发明采用以下的技术解决方案：

一种通用型基因打靶载体的构建方法，其特征在于，该方法选择正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)，其中，在正选基因(neo)的两端加入Loxp序列，将正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)分别连入克隆载体pGEM-3Z，合成含有Bsp14071，Nhe1，Not1，Bsu151(Cla1)，Bst11071，Pf12311，Spe1，Pst1，Sac II等稀少酶切位点的序列，将这段序列插入正选基因和负选基因之间，正选基因和负选基因之间的酶切位点为稀少的酶切位点，在大多数基因上不存在这些酶切位点，从而便于不同基因作为同源臂插入，从而构建通用型基因打靶载体。

本发明的方法构建的通用型基因打靶载体，打靶载体中留有的酶切位点可以用于克隆入大部分基因，从而可以选择大部分基因作为打靶载体的同源臂克隆入这个载体，在打靶载体正选基因的两端加上Loxp序列便于后续工作中去除正选基因。

附图说明

图1是通用型打靶载体的构建简图；