[发明专利]含有外周血干细胞的组织工程皮肤及其制备方法

权利要求书

1.一种含有外周血干细胞的组织工程皮肤，其特征在于：是由外周血干细胞、皮肤成纤维细胞、表皮细胞和生物支架材料制成，是将外周血干细胞、皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成；所述的外周血干细胞是由自体来源的外周血干细胞。

2.根据权利要求1所述的组织工程皮肤，其特征在于：所述的生物支架材料是机体可接受的生物可降解材料，包括胶原、细胞外基质复合物、壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、聚乳酸、聚羟基乙酸的一种或是几种的组合；其中细胞外基质复合物包含有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的成分。

3.按照权利要求1所述含有外周血干细胞的组织工程皮肤的制备方法，包括有培养基配制、生物支架材料制备、以及组织工程皮肤的三维培养，其特征在于，具体步骤如下，

步骤1.按9∶1的体积比将RPMI1640商用培养液与胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素2～50ng，氢化可的松10～500μg，表皮细胞生长因子2～10μg，碱性成纤维细胞生长因子2～50ng，腺嘌呤12～17mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：

培养基a  基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml+巨噬细胞集落刺激

                                         因子50ng/ml

培养基b  基础培养基+氯化钙0.1～1mM

培养基c  基础培养基+氯化钙0.2～2mM

培养基d  基础培养基+氯化钙0.3～3mM

步骤2.在4℃条件下，按质量比将胶原7～10∶壳聚糖0.5～1∶透明质酸2～3∶硫酸软骨素0.5～1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为10mg/ml～20mg/ml的溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为110mg/ml的RPMI1640商用培养液，调pH至7.2～7.4，制成凝胶溶液；将尼龙膜浸透凝胶溶液后，置于培养皿中固化形成支撑膜；

步骤3.将体外培养的外周血干细胞和成纤维细胞分别按1×10⁵～5×10⁵个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化后形成真皮细胞层，加入基础培养基培养2～4天，每天换液；

步骤4.在真皮层表面，按1×10⁵～5×10⁵个/cm²的密度接种表皮细胞，加入培养基a培养1天，形成皮肤雏形；

步骤5.取培养支架置于另一培养器皿中，把制备的皮肤雏形取出放在培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐，培养1～2天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐，培养2～4天，培养期间每天换液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述外周血干细胞按以下方法获取：将生理盐水与肝素按2∶1的体积比混合稀释，将患者新鲜血液与稀释后的肝素溶液按1∶1的体积比混合均匀，采用Percoll密度梯度离心法，分离出血液中的外周血干细胞。