[发明专利]含有外周血干细胞的组织工程皮肤及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及一种含有外周血干细胞的组织工程皮肤的制备方法。

背景技术

皮肤作为人体与外界的屏障具有多种重要功能，由于烧伤、创伤、慢性溃疡等原因造成的皮肤缺损轻则引起感染，重则可导致脱水、电解质流失以及免疫功能下降乃至死亡等严重后果。传统治疗使用的自体皮肤移植存在有很多难以克服的缺点，组织工程皮肤的出现为治疗提供了新途径。目前组织工程皮肤的产品化研究中种子细胞的选择是关键问题之一。体细胞由于在体外增殖速度慢、培养周期长，对于一些难愈性溃疡的疗效不佳，因此寻找合适的种子细胞就成为研究焦点。随着干细胞研究的进展，能够从患者自体取材的多种成体干细胞由于其多向分化的特性得到了重视。

外周血中也存在着多种干细胞成分，如造血干细胞、循环成纤维细胞、血管内皮祖细胞、间充质干细胞等。与身体其他部位来源的成体干细胞相比，它们的最大优点是取材方便、对病人造成的痛苦少、不会有病毒感染和免疫排斥等，是较理想的组织工程种子细胞。循环成纤维细胞(Bucala R，Spiegel LA，Chesney J，et al.[J].Mol Med，1994，1(1)：71-81)是一类特殊的白细胞亚群，具有造血干细胞的表面标记，有生成和分泌胶原和其他细胞外基质的功能，在体外培养条件下可以分化为成熟的成纤维细胞和肌成纤维细胞。循环成纤维细胞在转换生长因子β诱导下表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，而α-SMA是肌成纤维细胞的特殊标记，并且它们与胶原生成关系密切。同时循环成纤维细胞能合成分泌血管生成因子，如基质金属蛋白酶9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子A(PDGF-A)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和结缔组织生长因子(CNTGF)等，能够促进新血管的形成(Hartlapp I，Abe R，Saeed RW，et al.[J].FASEB Journal，2001，15(12)：2215-2224)。除了以上提到的成熟成纤维细胞和肌成纤维细胞，循环成纤维细胞还具有向血管内皮细胞、神经细胞、表皮细胞等多种全层皮肤相关细胞分化的能力(Yong Zhao，David Glesne，and Eliezer Huberman.PNAS.2003；100：2426-2431)。这更有利于组织工程皮肤产品的血管化、表皮化和皮肤附件的构建。外周血干细胞中的造血干细胞和血管内皮祖细胞等也有利于组织工程皮肤的构建。

随着对外周血干细胞研究的深入，该细胞在组织重建中发挥的重要作用越来越受到研究者的重视。外周血干细胞的种种特性非常适合作为组织工程产品的种子细胞，参与组织工程皮肤的构建。经检索，目前尚未见有循环成纤维细胞参与的组织工程皮肤产品及其应用的报道。

发明内容

针对上述状况，本发明的目的就是提供一种含有外周血干细胞的组织工程皮肤及其制备方法，使所获得的组织工程皮肤具有防止体液流失、保护创面、改善创面血供并促进创面愈合的功能，适用于修复难愈性皮肤缺损。

本发明所提出的含有外周血干细胞的组织工程皮肤，其特征在于：是由外周血干细胞、皮肤成纤维细胞、表皮细胞和生物支架材料制成，是将外周血干细胞、皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成的具有活性的含外周血干细胞的组织工程皮肤。所述的生物支架材料是机体可接受的生物可降解材料，包括胶原、细胞外基质复合物、透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、聚乳酸或聚羟基乙酸的任一种或是几种的混合；其中的细胞外基质复合物包含胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的成分。所述的外周血干细胞是自体来源的外周血干细胞。所述的皮肤成纤维细胞为自体或是同种异体来源的皮肤成纤维细胞，或是可向皮肤成纤维细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。所述的表皮细胞是自体或是同种异体来源的皮肤表皮细胞，或是可向表皮细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。

本发明含有外周血干细胞的组织工程皮肤的制备方法，包括有培养基配制、生物支架材料制备、以及组织工程皮肤的三维培养，具体步骤如下，