[发明专利]一种肿瘤血管新生体外共培养模型

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤血管新生，特别涉及一种微囊化肿瘤细胞与内皮细胞共培养模型。

背景技术

在肿瘤生长早期，实体肿瘤生长到1到2mm后，其继续生长就会依赖新生血管的形成。在此之前，肿瘤细胞本身已经释放了大量的促血管新生因子诱导肿瘤血管新生。这些新生血管是肿瘤和外界进行物质交换的基础，血管新生与恶性肿瘤的发展、侵袭和转移密切相关。因此，研究血管新生的机理研究，特别是早期的肿瘤血管新生，显得非常必要和迫切。

建立肿瘤血管新生模型是研究其形成机制的重要手段。其中，体外共培养模型是模拟体内肿瘤血管新生的有效方法。

共培养是一种模拟体内微环境的最简单的模型，主要分为两种：直接接触共培养和非直接接触共培养。

直接接触培养主要是利用两种细胞或组织接触，通过旁分泌、自分泌分泌细胞因子或直接接触等相互作用方式，但两种细胞分离较困难，不便于观察和后续检测。

在本发明之前，非直接接触共培养是共培养体系中一者对另者的影响是通过旁分泌的细胞因子相互作用，但两者不接触。由于两种细胞容易分离，便于观察和不影响后续的检测。目前非直接接触共培养主要采用Martrigel胶、Transwell等。

Matrigel胶是一种从肿瘤中提取出来的促内皮细胞生长的细胞外基质复合物。在室温下，它形成类似于体内的细胞外基底膜的胶状结构，把内皮细胞培养在Matrigel胶内，内皮细胞表现出新生血管的特征。Matrigel胶方法的局限性是并不能很好模仿体内肿瘤和血管内皮的微环境，细胞分离及提取困难，而且细胞因子的弥散受到一定的影响。

Transwell是利用细胞分别培养在两个不同的两个室中，中间隔有孔底膜，细胞不能通过。上下两室的培养液时是相通的，从而两种细胞就通过各自分泌的可溶性细胞因子相互作用。在Transwell室内外的细胞易分离，但Transwell价格昂贵，尚未能很好模拟体内肿瘤生长，孔底膜不能有目的的隔离分子。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，设计、研制一种微囊化肿瘤细胞与内皮细胞共培养模型。

本发明的技术方案是：

一种肿瘤血管新生体外共培养模型，其步骤如下：

(1)取肿瘤细胞充分混匀于2％海藻酸钠溶液中；

(2)通过微囊发生器，将细胞混悬液喷入100mmol/L氯化钙溶液内使其胶化；

(3)待微胶珠硬化，生理盐水洗涤；

(4)与0.1％多聚赖氨酸溶液反应后，生理盐水洗涤；

(5)再与0.15％海藻酸钠溶液反应后，生理盐水洗涤；

(6)用55mmol/L的柠檬酸钠溶液液化微囊核心后，置于CO2培养箱中培养；

(7)微囊化肿瘤细胞直接用于共培养，或冻存；

(8)取内皮细胞贴壁培养或三维生长，加入微囊化肿瘤细胞于同一培养液中，共培养。

(9)分离肿瘤细胞与内皮细胞，分别行基因和蛋白检测以及培养液细胞因子的检测。

本发明的优点和效果在于微囊化肿瘤细胞生长很好模型了体内肿瘤生长，特别是肿瘤早期的生长方式；通过共培养的方法，很好的模拟了肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用的微环境；肿瘤细胞与内皮细胞极易分离；微囊化肿瘤细胞可以冻存于液氮中，一次制作，长期使用，大大降低了科研人力、财力需求；另外还可根据不同研究需要，改变微囊的直径、截流量和微囊内细胞密度。

具体分析如下：

细胞微囊化培养是固定化技术中的一种，它是用一层半透膜将细胞包裹在珠状的微囊里，从而使生物大分子和细胞不能从微囊里溢出，而小分子的物质、培养基的营养物质可自由出入半透膜，达到培养的目的。实际上，微囊里也是一种微小的培养环境，因而能使细胞生长良好。肿瘤细胞微囊化后呈三维立体生长，更接近于体内肿瘤早期生长特点，且微囊内肿瘤细胞生长旺盛，可通过分泌血管新生相关因子作用于内皮细胞，从而促进内皮细胞增生，两者共培养为肿瘤血管新生研究提供了一种新的研究手段。而且，微囊的分子截流量与所使用的多聚赖氨酸的分子量成正相关，因此通过调整多聚赖氨酸分子量大小，可控制微囊的通透性，为细胞间的分子作用特别是中小分子提供更为简便的研究手段。