[发明专利]固定化重组E.coli BL21－pET/aspC细胞制备L－高苯丙氨酸

说明书

技术领域

本发明涉及固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞制备氨基酸的方法，具体的说涉及将含天冬氨酸转氨酶的重组E.coli BL21-pET/aspC细胞固定化，通过转氨作用将底物α-羰基苯丁酸转化成L-高苯丙氨酸的方法。

背景技术

L-高苯丙氨酸及其酯是用来制备血管紧张素(ACE)抑制剂类药物的重要原料。它是目前世界上约20种抗高血压新药的共同中间体，例如Enalapril(依那普利)、Benazepril(贝那普利)、Lisinopril(赖诺普利)、Captopril(卡托普利)、Temocapril、Cilazapril(西拉普利)等。全球高血压病人至2006年可超过6.5亿。庞大的患者群体和高增长率，使得抗高血压药物市场增长势头非常明显。2006年全球高血压药物市场将达到385亿美元，到2007年市场容量预计将超过520亿美元。专利方面，依那普利(Merk公司)在2000年到期，贝那普利(Ciba-Geigy公司)在2002年到期，其它专利也于2005年前到期。在今后5年内ACE抑制剂作为非专利药，在抗高血压药物市场中所占的比率较大，以美元计约占25％。目前国内很多制药企业都在开发仿制ACE抑制剂类药物，因而L-高苯丙氨酸及其酯的需求将会急剧增加。

现行制备L-高苯丙氨酸的方法主要是化学合成法(CN1361098A)，步骤如下：(a)将甘氨酸酯或甘氨酸酯的加成盐与亚硝酸盐化合物低温下进行肟化反应，生产N-羟基亚胺基氯代乙酸酯(Cloroximidoacetate Ester)；(b)在有机碱存在下，将N-羟基亚胺基氯代乙酸酯与苯乙烯进行环加成反应生成异噁唑啉(Isoxazoline)；(c)在手性催化剂存在下，将加压氢化得到手性化合物L-高苯丙氨酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种用固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞连续生产L-高苯丙氨酸的方法，提高了细胞内酶的稳定性，减少了细胞内辅酶的流失，简化了分离工艺，使L-高苯丙氨酸制备产率大幅提高，降低生产成本。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种用固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞制备L-高苯丙氨酸的方法，将α-羰基苯丁酸与L-谷氨酸或L-天门冬氨酸混匀，调节pH至7.0～9.5，加入非离子型表面活性剂配成反应液，将固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞加入反应液中，在惰性气体保护下30～50℃反应4～24h，得白色混悬液，调节pH过滤得L-高苯丙氨酸。

α-羰基苯丁酸与L-谷氨酸按摩尔比为1:1～1.6的比例混合，固定化细胞(即固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞)与反应液的质量体积比为1％～5％，非离子型表面活性剂与反应液质量体积比为0.1％～0.6％。

上述非离子型表面活性剂优选为聚山梨酯--吐温(Tween)系列表面活性剂，最优为Tween-20，Tween-40，Tween-60，Tween-65，Tween8-0，Tween-85。

上述固定化细胞中所固定化的微生物细胞为含天冬氨酸转氨酶的重组E.coli BL21-pET/aspC。

重组E.coli BL21-pET/aspC的制备方法见专利CN1757737A。

重组E.coli BL21-pET/aspC的具体制备方法为：

天冬氨酸转氨酶aspC基因调自大肠杆菌K12(标准菌株)。由NCBI检索，根据报道的大肠杆菌K12(标准菌株)aspC序列经VectorNTI8.0软件设计引物如下：

正向引物：5｀ATGTTTGAGAACATTACCGC3｀

反缶引物：5｀GTTTGTCATCAGTCTCAGCC3｀。

采用PCR钓取大肠杆菌K12的天冬氨酸转氨酶基因aspC。

天冬氨酸转氨酶基因aspC与下述的组成型启动子(记为P123)相连，(该启动子的改变碱基部位见下划线)，获取P123-aspC。

TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATTGCAATTTCACACA

ACAACACACCTTAACACTCGCCTAACGTTAAAGTGTGTP