[发明专利]一种基于移动切割内切酶的DNA结合蛋白检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种非标记检测脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白的方法，这里的DNA结合蛋白主要是指具有特异DNA结合序列的调控因子，这里的移动切割限制性内切酶主要是指IIS型限制性内切酶，能够在识别位点之外切割双链DNA。属于生物医学中非标记检测的技术领域。

背景技术

DNA与蛋白质的序列特异性识别和相互作用在生物基因表达调控中发挥重要的作用，几乎所有疾病的发生和发展都与DNA结合蛋白的异常相关。DNA结合蛋白的研究已越来越受到人们的关注，成为基因组和蛋白质组研究的重要内容之一。对细胞或病态组织中某一或多种蛋白质的量的检测是至关重要的。

目前用于研究DNA与蛋白质的方法很多，如凝胶迁移率分析(EMSA)、足迹法(foot-printing)等。虽然这些常规的方法在序列特异性DNA结合蛋白的研究中发挥了重大的作用，但操作起来工作量大、费时费力，容易造成放射性物质的污染，而且还无法进行高通量的检测。当前也有一些利用非放射性标记对DNA结合蛋白进行检测的方法，但这些方法大部分在检测前必须对蛋白质进行荧光分子标记，这个过程中可能导致低丰度蛋白质的丢失，不利于提高检测效率和灵敏度，同时难以实现高通量的并行检测。最近在Nature Biotechnology、Nuclear Acid research及Clinic Chemistry等国际权威杂志上陆续报道了一些基于荧光染料的方法检测DNA结合蛋白，这些方法有效避免了放射性物质的污染，检测方便，但还是无法进行高通量操作。

IIS型(移动切割限制性内切酶)限制性内切酶是一种比较常见的II类限制性内切酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小适中，约为400-650个氨基酸；识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。该类型酶的结合位点和切割位点不在同一位置，且其切割位点除了与结合位点在碱基间隔数目上有特异性外，没有序列特异性，因此对于检测探针的DNA结合蛋白的结合位点序列可以任意选择组合，从而使该方法对任何DNA结合蛋白都适用，具有很好的通用性。

发明内容

技术问题：本发明的目的是针对上述不足之处提供一种基于移动切割限制性内切酶(IIS型限制性内切酶)的DNA(脱氧核糖核酸)结合蛋白非标记检测方法，其发展了一种非标记的可高通量并行检测的技术来检测细胞或组织中DNA结合蛋白质的丰度，尤其可以用来检测正常和病态组织中DNA结合蛋白含量的变化。

技术方案：本发明的一种基于移动切割内切酶(IIS型限制性内切酶)的脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白非标记检测方法是采取以下方案实现的：

双链寡核苷酸探针的设计：针对待检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别位点的序列信息设计一段双链寡核苷酸探针，其中一条单链5’端标记一个连接基团并固定到固相载体表面，另一条与之互补的单链的5’端引入一个信号分子；同时在含有待测DNA结合蛋白的识别位点的3’端设计一个特异的IIS型限制性内切酶识别位点，调节内切酶与待检测DNA结合蛋白识别位点间的碱基个数，使内切酶的切割位点位于待检测DNA结合蛋白结合位点之中；

其检测方法为：将可能含有待检测的DNA结合蛋白的溶液与固定化的上述双链寡核苷酸探针一起孵育，清洗未结合的溶液后将该固定化的双链寡核苷酸探针在IIS型限制性内切酶体系中进行酶切反应，最后检测固相载体表面残留的信号分子的强度实现间接检测溶液中含有的待检测的DNA结合蛋白的量。

“待检测的DNA结合蛋白的特异性DNA识别位点的序列信息”是指每一个DNA结合蛋白都能特异性地识别一段DNA碱基序列并能够结合到该序列位置上，不同的DNA结合蛋白其识别并结合的DNA碱基序列也不一样。

“使内切酶的切割位点位于待检测DNA结合蛋白结合位点之中”是指根据所选择的IIS型内切酶的识别位点和切割位点的信息，在双链探针上调节内切酶识别位点序列的位置，使该酶的切割位置正好位于DNA结合蛋白的结合位点之中。

“可能含有待检测的DNA结合蛋白的溶液”是指细胞的核提取物或蛋白质的表达产物或溶解有该DNA结合蛋白的缓冲液。

“固相载体”是指经过物理或化学修饰后能够共价耦合或者物理吸附生物分子的具有较大表面积的固体物质。

“探针上引入的信号分子”是指可以通过光、电、磁检测到的分子基团。