[发明专利]无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种无机磷诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

人体内磷的87％都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积为35-40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，＞70时，可发生转移性钙化。当乘积＜35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、[Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。

由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴离子(H₂PO₄^1-，HPO₄^2-)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。

磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。

酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的无机磷诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明无机磷浓度测定方法原理如下：

磷酸根+谷氨酰胺+腺苷二磷酸谷氨酰胺合成酶氨离子

+谷氨酸+腺苷三磷酸

氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+

水+辅酶

丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+

过氧化氢

这种方法应用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase；EC 6.3.1.2)酶(偶)联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase  ；EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase；EC 1.4.3.19)酶促反应连续监测法。谷氨酰胺合成酶作为作用酶，功能为将无机磷(磷酸根)酶解产生氨离子。丙氨酸脱氢酶的酶促作用使氨离子变成丙氨酸。甘氨酸氧化酶作为循环酶将丙氨酸再次变回氨离子，使谷氨酰胺合成酶酶解无机磷产生的氨离子不断地被重复循环利用。丙氨酸脱氢酶同时作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算无机磷的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液        100mmol/L

稳定剂        500mmol/L

还原型辅酶    0.25mmol/L

谷氨酰胺      10mmol/L

腺苷二磷酸    20mmol/L

丙酮酸        20mmol/L

谷氨酰胺合成酶10000U/L

丙氨酸脱氢酶  12000U/L