[发明专利]一种用枯草芽孢杆菌发酵制备脱苦氨肽酶的方法及应用

权利要求书

1.枯草芽孢杆菌脱苦氨肽酶的制备方法，其特征是：

A枯草芽孢杆菌发酵，收集发酵液：

(1)出发菌株：采用枯草芽孢杆菌Zj016为出发菌株；

(2)发酵培养基组成：玉米淀粉33～42g/L，豆渣粉27～35g/L，KH₂PO₄·12H₂O 0.16～0.32g/L，K₂HPO₄ 2.68～5.0g/L，NaCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O0.1～0.3g/L，0.1mol/L的CoCl₂ 1～3ml，用氢氧化钠调pH7.5；

(3)发酵条件：接种量8％，初始pH7.5～8，35～40℃，200～400rpm，培养15～16h；

(4)收集发酵液：将发酵液4℃ 10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液；

B用乙醇分级沉淀：

(1)向收集的上清液中加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为20％进行第一次醇沉，4℃以10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液；

(2)往第一次醇沉后的上清液中加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为40％进行醇沉，4℃以10000rpm离心10min后，弃上清，取沉淀；

(3)沉淀加入少量pH8.5含0.1mmol/LCoCl₂的Tris-HCl缓冲液溶解，4℃以10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液，即为氨肽酶溶液。

2.用权利要求1方法制备的脱苦氨肽酶的应用，其特征是：

(1)称取大豆分离蛋白溶于去离子水中配制成浓度为60g/L的悬液，90℃水浴10min；

(2)冷却至室温，用1mol/L NaOH调pH值至8.5；

(3)置于50℃水浴中，待悬液温度升至50℃，按氨肽酶、碱性蛋白酶与底物大豆分离蛋白的用量比都为10000U/g，同时加入两种酶，缓慢搅拌，用1mol/LNaOH滴定，维持pH在8.5±0.1，每隔30min记录一次碱液消耗量，水解反应4h；

(4)水解反应结束后使水解液迅速升至90℃加热20min，钝化蛋白酶；

(5)水解液4000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为大豆多肽。