[发明专利]一种用枯草芽孢杆菌发酵制备脱苦氨肽酶的方法及应用

说明书

技术领域

一种用枯草芽孢杆菌发酵制备脱苦氨肽酶的方法及应用，具体地说是利用枯草芽孢杆菌发酵生产收集发酵液，通过乙醇分级沉淀，获得脱苦氨肽酶制品，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。

背景技术

大豆蛋白水解生产大豆多肽是大豆深加工的一个重要方向，因为大豆多肽不仅具有良好的营养特性，还具有广泛的生理药理作用和比大豆蛋白更丰富的功能特性，所以大豆多肽是一种很有前景的功能性食品原料。随着生物技术的进步和生命科学的发展，生理活性肽的生理功能逐步被人们发现，并受到越来越多的重视，尤其是一些活性肽的结构和生理功能逐渐明确，推动了活性肽的研究，也促进了大豆肽的研究与开发。

美国在20世纪70年代初研究出了大豆多肽产品之后，美国公司建成了年产5000吨的食用大豆肽工厂。日本于20世纪80年代开展此方面的研究，日本不二制油公司、雪印和森永等乳业公司均已成功地将大豆肽用于食品生物技术产业。我国于20世纪80年代中后期也开始了大豆肽的研究，并取得了一些可喜的成果。但是，大豆多肽产品在国内市场仍属初级开发阶段，其生产工艺尚需进一步完善，目前要解决的主要问题是酶解过程的调控、游离氨基酸的含量、过小分子肽的分离及大豆活性肽风味的改善，避免产生苦味肽等问题。

大豆多肽产品带有不同程度的苦味会直接影响食品的风味，人们食用时会有一些“不愉快”，也在一定程度上限制了它在食品工业中的推广应用。研究证实当疏水性氨基酸残基处于多肽链的外侧时多肽呈现苦味，而单个的疏水性氨基酸苦味却低的多，因此采用外切酶将疏水性氨基酸从多肽链末端切去可以有效地减少苦味。基于此理论，本实验室筛选出一株枯草芽孢杆菌，生产的脱苦氨肽酶为外切酶，可以从多肽链的氨基端解离氨基酸，经本实验室研究该氨肽酶与碱性蛋白酶协同水解大豆分离蛋白，制备的大豆多肽无苦味，且二肽三肽等寡肽含量较高。

发明内容

本发明的目的是筛选一株能产具有脱苦效果氨肽酶的微生物，通过发酵培养、冷冻离心、乙醇分级沉淀等工艺，最终获得较纯的氨肽酶，整个工艺流程的收率为55％，酶的比活为1700U/mL，最适温度50℃，温度稳定范围45～70℃，最适pH8.0，稳定pH范围7.0～9.5。将该酶与碱性蛋白酶协同水解大豆分离蛋白，水解液几乎不呈现苦味，脱苦效果显著。

本发明的技术方案：将枯草芽孢杆菌接入以豆渣粉、玉米淀粉为氮、碳源的培养基中，以氢氧化钠调节发酵培养基pH，发酵培养，收集发酵液，用乙醇分级沉淀，获得粗酶，工艺为：

A枯草芽孢杆菌发酵，收集发酵液：

(1)出发菌株：采用枯草芽孢杆菌Zj016为出发菌株；【食品与发酵工业】2006年32卷第3期巳公开。

(2)发酵培养基组成：玉米淀粉33～42g/L，豆渣粉27～35g/L，KH₂PO₄·12H₂O 0.16～0.32g/L，K₂HPO₄2.68～5.0g/L，NaCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O0.1～0.3g/L，CoCl₂1～3ml(0.1mol/L)，用氢氧化钠调pH7.5；

(3)发酵条件：接种量8％，初始pH7.5～8.0，35～40℃，200～400rpm，培养15～16h；

(4)收集发酵液：将发酵液4℃以10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液；

B用乙醇分级沉淀：

(1)向收集的上清液中加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为20％进行第一次醇沉，4℃以10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液；

(2)往第一次醇沉后的上清液中加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为40％进行醇沉，4℃以10000rpm离心10min后，弃上清，取沉淀；

(3)沉淀加入少量pH8.5的Tris-HCL缓冲液(含0.1mmol/LCoCl₂)溶解，4℃以10000rpm离心10min后，弃沉淀，收集上清液，即为氨肽酶溶液。

C脱苦氨肽酶的应用