[发明专利]实时荧光定量检测肺炎衣原体的方法及试剂盒

权利要求书

1. 一种使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测样品中肺炎衣原体(CP)存在的方法，该方法包括：(1)提供包括样品、核酸扩增体系，和荧光监测体系的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的靶多核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，(5)分析扩增循环后产生的荧光量以确定靶多核苷酸的存在及其相对量；其中核酸扩增体系包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光监测体系包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸探针，特征在于所使用的寡核苷酸引物序列是：正向引物CP-F：5’-gct act gga aca aag tct gcg a-3’(SEQ ID NO：1)和反向引物CP-R：5’-cat tgt act cca atg tat ggc act a-3’(SEQ ID NO：2)，由正向引物CP-F向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内得到的引物序列或能与这段范围内的序列可以杂交的引物序列；以及由反向引物CP-R向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内所得到的引物序列或能与这段范围内的序列可以杂交的引物序列。

2. 根据权利要求1中荧光监测体系包括的寡核苷酸探针，特征在于所使用的寡核苷酸探针序列包括：寡核苷酸探针CP-P：5’-tta tca tga atg gca agt agg agc ctc tct atc tt-3’(SEQ ID NO：3)，以及由寡核苷酸探针CP-P向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内得到的探针序列或能与这段范围内的序列可以杂交的探针序列。

3. 根据权利要求1的方法，其中所说的样品选自但不限于外周血、痰液、咽拭子及血清。

4. 根据权利要求1的方法，其中所说的核酸扩增体系包括(a)耐热DNA聚合酶、(b)2’-脱氧核苷三磷酸、(c)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，和(d)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物；其中所说的荧光检测体系包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。

5. 根据权利要求1的方法，所说的方法进一步包括：(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，以计算出样品中靶多核苷酸的量。

6. 根据权利要求1的方法，其中所说的肺炎衣原体选自肺炎衣原体的任何一种变异株；其中所说的靶多核苷酸来自肺炎衣原体。

7. 一种使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测临床样品中肺炎衣原体的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有DNA提取液、PCR扩增反应液、稀释液、阴性参考品、阳性参考品和阳性标准品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

8. 根据权利要求7的试剂盒，其中用于靶多核苷酸扩增体系的正向和反向引物序列分别是5’-gct act gga aca aag tct gcg a-3’和5’-cat tgt act cca atg tat ggc act a-3’。

9. 根据权利要求7的试剂盒，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针序列是5’-tta tca tga atg gca agt agg agc ctc tct atc tt-3’。