[发明专利]实时荧光定量检测肺炎衣原体的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测临床样品中肺炎、支气管哮喘等疾病中的病原体肺炎衣原体(CP)存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期诊断CP感染以及诊断CP持续感染或反复感染的方法及所使用的试剂盒。

背景技术

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，CP)是1989年定名的衣原体属中的一个新种，是一种专性真核细胞内寄生物。CP广泛分布于世界各地，是儿童和成人急性及慢性呼吸道感染的常见病原体，不仅可引起咽炎、鼻窦炎、中耳炎以及下呼吸道感染如急性支气管炎和肺炎(临床表现以肺炎为主)，而且与支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、结节病、心血管疾病的发病有密切关系。

由于CP感染没有典型的临床表现，诊断主要依靠实验室，常规方法有病原体分离培养、直接检出和血清学实验。(1)CP分离培养方法复杂，费时，而且敏感性不高，难于培养，一般不用于临床诊断。(2)病原体的直接检出主要有免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，采用荧光标记或酶标记抗体检测标本中的衣原体，前者主要用于细胞培养中CP的识别，但灵敏度差；后者所用抗体为抗衣原体属特异性抗体，不能直接识别CP。均不适用于临床检测。(3)检测CP最常用的血清学方法是微量免疫荧光抗体检测法(MIF)，被公认为CP感染血清学诊断的金标准。人类感染CP后会出现抗CP血清抗体，初次感染时，大约在发病3周后出现IgM抗体，6-8周出现IgG抗体。由于病原体从进入机体进行复制和抗原刺激到产生抗体需要一段较长的窗口期(初次感染一般需要3周)，时间跨度长，不能满足早期病原体确诊的需要，不利于病人的早期诊断和治疗。

近年来，国内外对于CP感染机理和致病机制有深入了解，血清流行病学调查证实约50％的健康成人血清中肺炎衣原体IgG抗体阳性，而在呼吸道感染患者中阳性率更高。肺炎衣原体感染在人群中非常普遍，提示一方面可能人类易反复感染，另一方面可能与人体内存在持续感染有关。Maozed等发现(Moazed TC，Kuo CC，Grayston JT，et al.Evidence of systemic dissemin-ation of Chlamydia pneumoniae via macrophages in the mouse[J].J Infect Dis，1998，177(6)：1322-1325.)，肺炎衣原体可以隐藏在血内单核细胞中，故机体感染肺炎衣原体后，可通过单核巨噬系统在体内播散，导致持续感染。血清学检测是目前最常用的检查方法，但在诊断肺炎衣原体持续感染上的作用有限，需要测定比较前期和感染期血清抗体滴度，只能做回顾性诊断，不能有效确诊CP感染。因此，需要有一种方法来诊断肺炎衣原体持续感染。目前国内外有部分实验室采用聚合酶链反应(PCR)扩增靶核酸来检测外周血单核细胞(PBMC)中的CP，由于需要对PCR产物进行电泳或杂交分析等后处理，极易造成PCR产物污染，导致假阳性，不宜用于临床诊断；但提示，PBMC中的肺炎衣原体DNA可作为持续感染的标志。

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology.Nucleic Acids Res.2002 5；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitative PCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion inBiotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。