[发明专利]一种基于功能基因多态性的分子标记方法

权利要求书

1. 一种基于功能基因多态性的分子标记方法，其特征是利用已知物种的公用数据库中的gDNA、cDNA或EST序列信息，设计不同基因的特异引物和高频序列引物并配合其相应的退火温度，作为基于PCR的功能基因扩增多态性标记方法。

2. 据权利要求1所述的基于功能基因多态性的分子标记方法，其特征是通过下述步骤进行：

(1)根据公用数据库目的基因的cDNA或EST序列设计多对候选特异引物，经电子PCR后，选择只有一个PCR产物、扩增片段位于基因易变的中心区域及引物长度最短的一对特异引物，进一步实际PCR验证其特异性并确定所需退火温度；

(2)根据公用数据库目的基因的gDNA序列，分别按2个、3个和4个不同碱基可能的排列组合，查找在目的基因gDNA序列中出现频率高的序列为高频序列引物的3`端选择性碱基，然后在5`端填充不同碱基以合符一般引物设计要求；

(3)根据目的基因序列同源性分析，在公用数据库已知的同源性基因家族各序列中，分别按2个、3个和4个不同碱基可能的排列组合，查找共同出现频率高的序列为高频序列引物的3`端选择性碱基，然后在5`端填充不同碱基以合符一般引物设计要求；

(4)以上游特异引物与不同的下游高频序列引物组合、下游特异引物与不同的上游高频序列引物组合；以前4-8个循环采用低退火温度，循环次数在第4-8到第34-42次采用特异性扩增所需的高退火温度，进行PCR、凝胶电泳后筛选基因多态性引物组合；

(5)进一步地，从生物体提取RNA后，经反转录酶将RNA反转录为cDNA，以目的基因下游特异引物与上游高频序列引物组合；以前4-8个循环采用低退火温度，循环次数在第4-8到第34-42次采用高退火温度，进行PCR、凝胶电泳后检测基因表达多态性。

3. 据权利要求1或2所述的基于功能基因多态性的分子标记方法，其特征是：其中所用的特异引物是指在gDNA中仅能扩增出一条带的一对引物，引物长度为能扩增出特异带所需的最少碱基数，且某一基因上游特异引物能与下游不同高频序列引物组合、下游特异引物能与上游不同高频序列引物组合，形成该基因以特异带区段为中心向一侧或两侧延伸至PCR所能扩增范围的检测方法。

4. 据权利要求1或2所述的基于功能基因多态性的分子标记方法，其特征是：其中所用的高频序列引物是指某一基因和/或同源性基因家族中，根据gDNA序列片段，包括外显子的编码区、非编码区；内含子及在特异引物上、下游PCR可能扩增的范围，查找2-4个不同碱基种类的各种排列组合中出现高频率的序列，或是单核苷酸多态性位点的序列，作为引物3`端选择性碱基，引物5`端填充适当碱基以满足与特异引物配对及退火温度要求，同一高频序列引物可设计为上、下游引物，将基因中高频率出现的2-4个碱基短序列作为选择性碱基，以增加长度多态性条带和引物结合位点的检测。

5. 据权利要求1或2所述的基于功能基因多态性的分子标记方法，其特征是：其中PCR所用的相应退火温度是指两种退火温度：PCR中循环次数在第1到第4-8次时采用33-39℃的低退火温度，循环次数多少和退火温度高低根据高频序列引物中选择性碱基数而定，循环次数在第4-8到第34-42次采用高退火温度，其退火温度高低根据该对特异引物能扩增特异带所需的最低退火温度。

6. 据权利要求1或2所述的基于功能基因多态性的分子标记方法，其特征是：该方法应用于对单基因多态性分子检测，对同源性基因家族多态性分子检测或对mRNA表达多态性的分子检测。

7. 根据权利要求6所述基于功能基因多态性的分子标记方法，其特征是：其中，对单基因多态性分子检测，包括基因编码序列、非编码序列、内含子序列及基因两侧PCR所能扩增范围的序列长度多态性和选择性碱基结合位点的检测。

8. 根据权利要求6所述基于功能基因多态性的分子标记方法，其特征是：其中，对同源性基因家族多态性分子检测，包括利用已知物种同源性基因家族的序列，设计通用高频序列引物，对已知物种或未知物种同源性基因家族多态性检测。

9. 根据权利要求6所述基于功能基因多态性的分子标记方法，其特征是：其中，对mRNA表达多态性的分子检测，主要是提取RNA并经反转录酶转录为cDNA后，使用基因下游特异引物与上游高频序列引物组合对cDNA扩增多态性检测。