[发明专利]一种基于功能基因多态性的分子标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因组学、分子生物学和生物信息学领域，具体说是涉及一种基于PCR的功能基因扩增多态性(Function Gene Amplified Polymorphism，FGAP)标记方法。用于gDNA单基因多态性、同源性基因家族多态性和mRNA表达多态性分析。

背景技术

分子标记是生物DNA水平上遗传变异的直接反映，具有数量丰富、信息量大、检测不受季节、环境和个体发育阶段的影响等优点，广泛应用于遗传作图、基因定位、基因克隆、动植物育种、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、遗传病鉴定、法医学鉴定等许多领域。

目前分子标记技术主要有：DNA限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(AmplifiedFragment Length Polymorphism，AFLP)、简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)、特殊序列扩增(sequence characterized amplified regions，SCAR)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)、表达序列标签(expressed sequence tags，EST)等。由于PCR技术的优点，基于PCR的标记体系类型多样，应用广泛，但各自的复杂性、可靠性与遗传信息不同。

RFLP基本原理是将基因组DNA用已知的限制性内切酶消化，电泳经Southern印迹后，用放射性同位素或非放射性物质标记探针，与转移于支持膜上的DNA杂交，经放射自显影显示出基因组DNA中与探针同源的DNA序列片段的大小。RFLP标记呈共显性，标记准确，不影响表型，数目也较多，但其分析程序复杂，有放射性污染，技术难度大，费时，成本较高，需要的DNA量较大等。RAPD是用短的(通常为10bp)随机序列DNA作为引物，对目的基因组DNA进行PCR扩增而产生多态性。RAPD程序简单、快速，所需DNA量少，能分析大量样品，且无需知道目的DNA片段序列信息。但是RAPD受反应条件影响较大，因而其检测的重复性较差。(罗林广等，分子标记及其在作物遗传育种中的应用.江西农业学报，1997，9(1)：45-54)。AFLP标记是RFLP与RAPD相结合的产物，该法先设计针对某种限制性内切酶的通用接头以及可与接头序列和限制性酶切位点的序列配对的专用引物，用上述内切酶消化基因组DNA，将通用接头与限制性片段两端连接，再用专用引物扩增，最后电泳显示结果。AFLP具有标记多态性强、准确性高、重复性好以及可用于没有任何分子生物学研究基础的物种等优点，但AFLP成本较高、对技术要求苛刻等。(相宁，洪焰.扩增片段长度多态性技术及其在植物研究中的应用.植物生理学通讯，2000，36(3)：236-240；周晓梅，沈晋良.扩增片段长度多态性的研究进展.棉花学报，2003，15(3)：185-190)。SSR是根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。但要获得SSR引物需要进行大量克隆、测序和杂交验证工作。(王长有，吉万全，薛秀庄.分子标记技术在小麦遗传育种中的应用现状.麦类作物学报，2000，20(4)：75-80)。SCAR标记十分稳定，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，非常适合于样品的大量分析。SCAR标记一般是由RFLP、RAPD、AFLP等标记转换而来。如王斌等“紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法”(发明申请号：200310105267)；杨剑波等“鉴别水稻苯达松敏感致死基因的分子标记方法”(发明申请号：02138080)。但通常情况下，SCAR标记转换的成功率是很低的，这也是目前发展SCAR标记的一个主要困难。SNP是指在基因水平上由于单个核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异而引起的DNA序列多态性，与RFLP及微卫星等DNA标记不同，不再以长度的差异作为检测手段，而是直接对序列的变异作为标记。但大多数普通类型的SNP信息量不大，且大规模地筛选SNP，费用极其昂贵等。