[发明专利]一种溶癌病毒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及溶癌病毒及其制备方法，尤其涉及一种重组肿瘤特异的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体溶癌病毒及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是目前严重威胁人类生命健康的重要疾病之一。尽管手术、放疗和化疗等传统治疗手段已经有较大的发展，但大多数的晚期肿瘤患者仍死于癌症本身。常规化疗虽然对恶性肿瘤有一定的疗效，但多数肿瘤在多疗程化疗后会出现因对化疗耐药而继续发展而致命。所以，寻找新的治疗手段和策略对提高恶性肿瘤的治疗水平将非常必要和迫切。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)是近年才发现的一个新的肿瘤坏死因子家族配体。其因在体内外试验中有强大的抗肿瘤作用且无多药耐药性的特点而成为目前肿瘤治疗中的热点之一。临床前的研究已经证实，TRAIL能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，瘤内注射能抑制肿瘤的生长并延长动物肿瘤模型的生存期，并与多种化疗药物如阿霉素、顺铂、CPT-11和放疗均有很好的协同作用，甚至对耐化放疗的肿瘤仍然有较好的疗效，提示其为一种非常有前途的抗癌药物。我们和其他的研究结果表明，通过用腺病毒为载体，能很好地将TRAIL基因转染入多种肿瘤细胞表达膜连接的TRAIL而导致其凋亡。并因其产生膜连接的TRAIL有旁观者效应(bystander effect)从而明显增强TRAIL的抗肿瘤活性，其抗癌活性甚至强于可溶性的TRAIL。

研究证实，TRAIL对体外原代培养的人肝细胞和人的脑组织培养有严重的毒性，从而引起了对TRAIL运用于临床肿瘤治疗的潜在毒性的担忧。如何减少TRAIL对这些器官的毒性将为TRAIL进入人体临床研究扫清重要的障碍。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种溶癌病毒及其制备方法，解决肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因治疗的相关毒性问题。

为了实现上述目的，本发明的溶癌病毒的技术方案为：一种溶癌病毒，其组成成分包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)、腺病毒载体(Ad)和巨细胞病毒(CMV-E)。

所述溶癌病毒的构建形式为：

本发明制备所述溶癌病毒的方法包括如下步骤：

(1)TRAIL基因的扩增、克隆和测序：根据GenBank报道的TRAIL基因的序列及文献报道设计合成引物，进行PCR扩增，PCR产物用胶回收试剂盒回收纯化，纯化后的产物常规进行酶切鉴定和DNA序列分析；

(2)Ad/gTRAIL表达载体的构建：hTERT靶向到TRAIL基因上。将纯化的TRAIL基因PCR产物片段，通过连接酶定向插入hTERT载体中，构建成Ad/gTRAIL的腺病毒载体，再通过GAL4的调控子增强hTERT介导的GFP/TRAIL融合基因的表达；

(3)Ad/gTRAIL表达载体与溶癌病毒载体的重组：在Ad/gTRAIL的腺病毒载体基础上与溶癌病毒载体进行重组，组成一个新的病毒，称之为重组肿瘤特异的TRAIL溶癌病毒(Ad/TRAIL-E1)；Ad/TRAIL-E1进行进一步扩增纯化后，用紫外分光光度计测定纯度并定量。

与现有技术相比，本发明成功构建了通过hTERT启动子特异性表达TRAIL蛋白的腺病毒载体(简称Ad/gTRAIL)。在初步的临床前的研究中证实，Ad/gTRAIL有广泛强大的抗肿瘤作用包括对耐化疗的人类肿瘤有效，特别的是对体外原代培养的人肝细胞、正常细胞和动物无毒性。而用非肿瘤特异性的CMV或PGK-GV-16为启动子的TRAIL，则产生了严重的肝毒性。说明hTERT能使TRAIL靶向表达在肿瘤细胞，从而避免了其肝细胞毒性。在Ad/gTRAIL基础上与溶癌病毒载体进行重组，组成一个新的病毒，我们称之为重组肿瘤特异的TRAIL溶癌病毒(Ad/TRAIL-E1)。新型Ad/TRAIL-E1克服了TRAIL基因进行抗肿瘤治疗效力较弱的特点，能够在肿瘤细胞中进行自我复制，增加基因在肿瘤细胞的拷贝数或是在肿瘤细胞中的表达水平，从而增强Ad/TRAIL-E1的抗肿瘤作用。

附图说明

图1是Ad/gTRAIL对人多种肿瘤细胞株的强凋亡诱导作用示意图；在图1中，H460：人非小细胞肺癌细胞株；A549，H1299：人肺腺癌细胞株；DLD-1：人结肠癌细胞株；Lovo：人大肠癌细胞株；PBS：磷酸盐缓冲液；GFP：绿色荧光蛋白；G-TRAIL：GFP-TRAIL融合基因；GT-TRAIL：GFP-hTERT-TRAIL融合基因。