[发明专利]土豆磷酸化酶的分离提取方法

说明书

                         技术领域

本发明涉及一种磷酸化酶的分离提取方法，特别是指一种土豆磷酸化酶(E.C.2.4.1.1)的分离提取方法。

                         背景技术

多糖如同蛋白质和核酸一样，在生命活动中起着重要作用。但是多糖的合成远比蛋白质和核酸复杂，这是由其较为复杂的结构所决定的。最近研究发现，通过酶促反应合成多糖是一个新的发展方向。由于酶具有专一性和酶促反应步骤简单的优点，该方法已被应用于合成多种复杂的多糖。这将有利于进一步研究多糖结构与其生物活性之间的关系，促进多糖在医药业和农业上等领域的应用。

相关研究表明，土豆磷酸化酶(E.C.2.4.1.1)可应用于合成结构可控的直链淀粉多糖。但目前尚未见有关直接从土豆中分离提取土豆磷酸化酶的研究工作和相关技术报道，更未见工业化生产土豆磷酸化酶。

                         发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种工艺简便、比活力高的土豆磷酸化酶的分离提取方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种土豆磷酸化酶的分离提取方法，包括如下步骤：

(1)将450～800克土豆去皮、切块，搅碎成土豆汁；在土豆汁中加入亚硫酸钠溶液，使土豆汁混合溶液中亚硫酸钠的浓度为0.1～0.3克/升；高速冷冻离心土豆汁，除去白色沉淀物A即土豆淀粉，调节上层离心清液I的pH至6.0～8.0。

(2)加热离心清液I至50～70℃，恒温搅拌30～90分钟，高速冷冻离心，除去白色沉淀物B即失活的淀粉酶，得到离心清液II。

(3)在离心清液II中加入硫酸铵溶液，调节溶液密度至1.05～1.10克/毫升，于0～4℃静置2～6小时后，高速冷冻离心，除去白色沉淀物C即杂蛋白，得到离心清液III。

(4)在离心清液III中加入硫酸铵溶液，调节溶液密度至1.15～1.25克/毫升，于0～4℃静置6～12小时后，高速冷冻离心，收集白色沉淀物D即为粗土豆磷酸化酶。

(5)将步骤(4)收集的粗土豆磷酸化酶溶于15～25毫升缓冲溶液中，高速冷冻离心，除去不溶性杂质，制得土豆磷酸化酶液。

本发明制得的土豆磷酸化酶液经磷钼蓝吸光光度法(波长为860nm，如图2所示)和蛋白质紫外吸收法(波长为280nm，如图3所示)检测，可计算出其比活力，于冰箱中0～4℃低温保存，活性可保持2个月。

为了更好地实现本发明，所述步骤(1)～步骤(5)中高速冷冻离心条件：温度为2～6℃，转速为10000～20000转/分，时间为10～50分钟。

所述步骤(1)中的亚硫酸钠的作用是抑制酚氧化酶产生的变色反应，其在土豆汁混合溶液中的浓度为0.1～0.3克/升。

所述步骤(1)中的上层离心清液I的pH值采用浓氨水、碳酸钠溶液或氢氧化钠溶液等调节。

所述步骤(5)中的缓冲溶液的pH为6.5～7.6，特别优选的缓冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或者硼酸-硼砂缓冲液。

本发明的原理是采用硫酸铵分级盐析法，从土豆中分离出土豆磷酸化酶。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明通过硫酸铵分级盐析法直接从新鲜土豆中提取具有较高比活力的土豆磷酸化酶。本发明的操作步骤主要为高速冷冻离心，本发明工艺简单，操作方便，易于实施，造价低廉，易于从土豆中分离纯化制得具有较高比活力的土豆磷酸化酶。本发明提取出的土豆磷酸化酶可以用于高效合成结构可控的直链淀粉多糖。本发明制备的土豆磷酸化酶可广泛应用于医药、食品、保健、生物、农业等领域。

                         附图说明

图1是本发明分离提取土豆磷酸化酶的工艺流程图。

图2是磷钼蓝的吸收曲线。

图3是蛋白质的紫外吸收曲线。

                       具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

如图1所示，土豆磷酸化酶的分离提取方法，包括如下步骤：