[发明专利]HLA－B27磁性酶联免疫试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒，主要包括酶稀释液，酶结合物，其特征是，还包 括有：包被有与HLA-B27抗体共价耦联免疫磁性微珠的微孔板板条，

所述微孔板板条的制备如下：共价耦联免疫磁性微珠和HLA-B27抗体：PBS，pH6.5-7.5 洗涤1ml免疫磁性微珠1-5次，加入抗体8-12mg/ml，共1ml，混匀后，加入双功能耦联剂 BS³，使其终浓度为0.8-1.2mM，室温孵育20-40min，加入终止液0.7-1.2M Tris缓冲液，pH6.5 -7.5，室温孵育7-13min，用PBS洗涤2-5次，恢复体积1ml；包被微孔板：将与步骤(A) 制备的HLA-B27抗体共价耦联免疫磁性微珠2-4ul/孔加入到微孔板中；

所述酶稀释液为1％BSA、0.1％Proclin300的0.01M PBS；

所述酶结合物为与抗CD45抗体耦联的HRP，HLA-B27抗体与酶结合物的稀释度为1∶ 50。

2.根据权利要求1所述的HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒，其特征是，还包括有HRP耦 联HLA-B27抗体分子的阳性对照。

3.根据权利要求1-2任一所述的HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒，其特征是，该试剂盒 用于检测的全血标本是以EDTA-K3作为抗凝剂。

4.一种制备权利要求1所述HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒的方法，其特征是，主要包括 以下步骤：

(A)共价耦联免疫磁性微珠和HLA-B27抗体：PBS，pH6.5-7.5洗涤1ml免疫磁性微珠1-5 次，加入抗体8-12mg/ml，共1ml，混匀后，加入双功能耦联剂BS³，使其终浓度为0.8-1.2mM， 室温孵育20-40min，加入终止液0.7-1.2M Tris缓冲液，pH6.5-7.5，室温孵育7-13min，用 PBS洗涤2-5次，恢复体积1ml；

(B)酶结合物的制备；

(C)包被微孔板：

将与步骤(A)制备的HLA-B27抗体共价耦联免疫磁性微珠2-4ul/孔加入到微孔板中。

5.根据权利要求4所述的上述HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征是：所 述酶结合物的制备为：称取10mgHRP置于干净容器中，加入0.2mol/L pH为5.6的醋酸盐缓 冲液，待酶溶解后，加入0.06mol/LNaIO₄溶液，室温反应10-30分钟；加入0.16mol/L乙二 醇-10％氯化钠溶液，于室温下反应10-30分钟后装入透析袋中，用0.001mol/LpH为4.0的醋 酸盐缓冲液透析过夜；加入2mol/L pH为9.6的碳酸盐缓冲液，加入待标记的抗CD45抗体 9-11mg后，4℃搅拌反应2小时，然后加入新配制的浓度为5mg/ml的NaBH₄溶液，4℃搅拌 反应1-3小时；滴加饱和的(NH4)₂SO₄溶液，4℃搅拌放置20-40分钟，离心10-30分钟， 弃上清，将沉淀溶于0.02mol/LpH为7.4的磷酸盐缓冲液；用0.02mol/LpH为7.4的磷酸盐缓 冲液透析18-30小时，取出透析液，加入等体积酶保护液后，再加入等体积甘油，混匀。

6.根据权利要求4所述的上述HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征是：步 骤(C)加入到微孔板中的HLA-B27抗体共价耦联免疫磁性微珠为3ul/孔。

7.根据权利要求4-6任一所述的上述HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒的制备方法，其特 征是：共价耦联免疫磁性微珠和HLA-B27抗体为：PBS，pH7.0洗涤1ml免疫磁性微珠3次， 加入抗体10mg/ml，共1ml，混匀后，加入双功能耦联剂BS³，使其终浓度为1mM，室温孵 育，30min，加入终止液1M Tris缓冲液，pH7.0，室温孵育10min，用PBS洗涤3次，恢复 体积1ml，然后加入1％BSA作为稳定剂，0.1％NaN₃作为防腐剂。