[发明专利]低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物诱变技术领域，特别涉及利用低能离子诱变手段诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产突变株的方法。

背景技术

植物病原菌对农用抗生素产生耐药性是全球面临的严峻挑战之一，寻找能有效抑制抗药菌的农用抗生素是解决这一问题的根本途径。

“灰色变异链霉菌”(拉丁文名称为“Streptomyces griseovariabilis”)是一种链霉菌属放线菌。其发酵产物可提取万隆霉素(英文名“Wanlongmycin”)，属于喹喔啉类抗生素(Quinoxaline antbiotics)家族的环状酯肽类抗生素，它是由10个氨基酸残基组成的环状酯(缩)肽，两个独特的喹喔啉发色团以酰胺键对称地结合在环状酯(缩)肽上。它对植物卵病菌病害有很好的防治效果。

万隆霉素产生菌是1996年从土壤样品中分离筛选出来的，经过10年的研究，已在万隆霉素的生物活性、理化特性、抑菌谱、分离纯化、分子结构、发酵工艺、菌株的鉴定、抑菌作用机理、定量构效关系等方面取得很大的进展。但至今还未有相关的商业产品，主要原因是万隆霉素产生菌原始菌株的产素水平比较低，产素品质较差，生产成本相对较高，从而阻碍了万隆霉素的工业化进程。应用高效简便的诱变选育技术是加快万隆霉素工业化进程的关键。

低能离子束注入用于微生物诱变育种较为广泛，它是一种集物理化学效应为一体的综合诱变技术，能引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，大幅度提高变异的频率。低能离子束注入诱变技术表现出对生物体生理损伤小、突变谱广、突变频率高，并有一定的重复性和方向性的新特点。王付转等采用离子束处理利福霉素产生菌，从126株初筛菌株诱变出了产素能力较原始菌株高出42.7％的高产菌株。赵洪英等采用低能离子对庆大霉素产生菌的成熟孢子进行了诱变处理，选育到一株庆大霉素产量提高27.39％的高产菌株。而把低能离子束注入在生产万隆霉素菌株的选育，则还未有相关专利和文献报道。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法，利用该方法可以有效提高万隆霉素的产量。

本发明所采用菌株是从土壤样品中分离的放线菌，菌株被命名为Streptomyces griseovariabilis subsp.Bandungensis n.subsp.GAAS2507(详见专利号为03140091.4的中国发明专利)，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏号为CCTCC：M203059，保藏时间是2003年7月7日。菌株GAAS2507的形态特征为：菌株孢子丝为松散螺旋形，孢子表面光滑，在高氏一号培养基上，其气丝呈烟灰色，基丝无色至黄白色，不产色素。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种低能离子诱变灰色变异链霉菌选育万隆霉素高产菌株的方法，包括以下步骤：在室温下，将0.1～0.3mL灰色变异链霉菌的孢子悬浮液于无菌平皿内涂布均匀，在无菌状态下吹干，使其形成一层菌膜，采用能量为10～30Kev的氮离子束，剂量为7.8×10¹⁴～28.6×10¹⁴ions/cm²的条件下进行脉冲注入，然后用0.5～1.0mL无菌水洗下诱变处理过的菌膜，稀释至10³～10⁶倍后涂布于含0.6～1.0μg/mL链霉素的高氏一号培养基平板中，28～32℃培养7～10天，选取生长良好的单菌株接种于盛有100mL液体发酵培养基的摇瓶中，于28～32℃，160～200rpm摇床中培养96～120h，获得诱变的遗传性状稳定的纯灰色变异链霉菌。所述灰色变异链霉菌为模式菌GAAS2507(详见专利号为03140091.4的中国发明专利)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏号为CCTCC：M203059，保藏时间是2003年7月7日。

为了更好地实现本发明，所述孢子悬浮液是按下述方法配制而成：取灰色变异链霉菌的斜面孢子，用无菌水制成10⁶～10⁸个/mL的孢子悬浮液。

所述生长良好的单菌株为菌落直径大，产孢量大的单菌株。