[发明专利]新的信号芋螺O－超家族毒素序列、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种中国南海信号芋螺O-超家族毒素基因Lt6.3及其编码的多肽序列lt6c和该种多肽的制备技术，以及该种毒素在神经生物学研究，离子通道药物和镇痛药物开发中的应用。

背景技术

芋螺属于软体动物门腹足纲芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的浅海水域，少数在水深几米至200余米的深水区，因外形呈圆锥形或芋头状而得名。芋螺是比较年轻的生物，化石记录证明芋螺属最早出现于始新世(Eocene)，中生代(mesozoic)时期与陆地上恐龙同时灭绝的海洋捕食性软体动物菊石的消失客观上促进了芋螺的第一次大规模的物种形成。芋螺的第二次大规模的辐射始于中新世(Miocene)，基本上持续到现在。每个芋螺物种的形成都伴随全新的毒液成分和有效的毒液输送装置的进化。

芋螺具有强大的自然进化能力，全球有约500种芋螺，单一种属中就包括数百种物种，这使芋螺成为海洋无脊椎动物中进化最成功的生物。芋螺是食肉动物，靠毒液来捕食，根据其捕食习性可分为食鱼芋螺(piscivorous)、食螺芋螺(molluscivorous)、食虫芋螺(vermivorous)。食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70％左右。食鱼性芋螺占芋螺总数最少，但毒性最强，报道的芋螺致死事件基本上是该类芋螺造成的，如织锦芋螺(C.textile)、地纹芋螺(C.geographus)等。

芋螺毒液是捕食与防御作用的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素能特异地作用于神经系统的电压门控和配体门控离子通道的不用亚型和递质受体，因此被广泛用于神经生物学研究。芋螺毒素通常为由7～41个氨基酸残基组成的小分子多肽。大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素比较(40～80个氨基酸左右)，芋螺毒素的肽链短得多，富含二硫键，分子结构更为紧密，生物活性更高。大多数芋螺毒素均由单一的mRNA编码，原始的翻译产物是一种特定的多肽前体，约为70-120个氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到成熟肽。

二十世纪八十年代初，美国犹它大学Olivera BM学者实验室最早开展了芋螺毒素全面系统研究工作。芋螺毒素以其分子小，结构稳定，对受体作用范围广并且活性强的特点，已经跃居于动物神经毒素研究的首位。由于它们作用靶点广泛，能高度特异地结合细胞膜上神经递质和激肽的受体和各种离子通道，一方面，可以被直接开发成药物或作为新药的先导化合物应用于临床；另一方面，可以成为神经生物学中发现鉴定新受体，研究受体构效关系及其调控细胞分子机理的重要探针，并推动了离子通道的进化研究。

保守估计有50000种以上不同的芋螺毒素存在，至今已经得到分离的芋螺毒素有近千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的ω-CTX M VIIA(SNXIII，商品名：Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了III期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于ω-CTX C VID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已完成I期临床试验。芋螺毒素药用研究的其他方向还有：具有去甲肾上腺素转运蛋白抑制作用的T-超家族芋螺毒素，可用于治疗抑郁症。以及抑制α1-肾上腺素受体的一些芋螺毒素，可用于治疗良性前列腺过度增生引起的尿失禁。与此同时，围绕着增强药物分子的稳定性，降低过敏反应以及增加溶解性以利于口服目的的分子改造研究工作也正在进行。

另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。