[发明专利]一种制备别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种制备别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法。

技术背景

藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白含alpha(α)和beta(β)亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得藻红蛋白主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；藻红蓝蛋白吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；藻蓝蛋白吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；变藻蓝蛋白吸收约650～660nm的可见光，发射约660～670nm的荧光。藻红蛋白结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB)；藻红蓝蛋白的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB)；藻红蓝蛋白的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)；藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。

藻胆蛋白具有提高人体免疫力，促进动物血细胞再生等功能，能抑制癌细胞生长，对癌细胞有很强的杀伤力，是一种无毒无副作用的理想光敏剂，可减轻肿瘤化疗的副作用。藻胆蛋白作为一种天然色素，也可作为高级天然色素应用于食品和化妆品中。藻胆蛋白由于还具有强烈的荧光性，在分子生物学上可用于制备荧光探针，适用于免疫学、细胞学、生理学和分子生物学等方面的研究。

藻蓝胆素生物合成基因由hol和pcyA组成，可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产藻蓝胆素(F.T.Landgraf，C.Forreiter，et al.Recombinant holophytochrome in Echerichiacoli[J].FEBS Letters，2001，508：459-462)。与前人的方法不同，在Anabaena sp.PCC7120中alr0617基因和Synechocystis sp.PCC6803中slr2049基因分别编码beta裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的beta裂合酶。这些beta裂合酶能催化藻蓝胆素与别藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白及其同源蛋白质共价结合，从而生成具有优良荧光性质的别藻蓝蛋白类荧光蛋白质。在绝大部分的蓝藻和红藻中，都存在有编码藻红蛋白脱辅基蛋白、藻蓝蛋白脱辅基蛋白、变藻蓝蛋白脱辅基蛋白、beta裂合酶以及藻蓝胆素生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有异形胞的蓝藻中存在藻红蓝蛋白；隐藻中没有藻胆体，不存在上述基因中的变藻蓝蛋白的基因。

藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域，目前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法，CN1344723，2002.04.17，一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083，2005.01.12)；本方法不利用藻类作为原料，而是利用基因工程方法生产别藻蓝蛋白；别藻蓝蛋白类荧光蛋白质具有优良的荧光性质，为了发展别藻蓝蛋白类新型荧光探针，可以分子设计别藻蓝蛋白类荧光蛋白质；本发明为别藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，它是应用beta裂合酶催化藻蓝胆素与别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备别藻蓝蛋白类荧光蛋白质；将含有beta裂合酶基因、别藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因和藻蓝胆素生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过这种方法得到的基因工程菌生产别藻蓝蛋白类荧光蛋白质。

本发明的目的是提供一种制备别藻蓝蛋白类荧光蛋白质的方法，包括以下：