[发明专利]一种检测抗体亲和力的方法

权利要求书

1.一种检测抗体亲和力的方法，其特征是，主要包括以下步骤：

(1)抗原包被微球：

-将50μL的微球活化，活化后的微球离心；

-吸弃上清，将微球重悬于pH＝5.0的200-300μL 50mM的MES缓冲液的溶液中，涡漩振荡10-30s，超声振荡10-30s；微球离心；该步骤重复一次；

-吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM的MES缓冲液(pH5.0)中，涡漩振荡约10-30s，超声处理约10-30s；

-往悬浮的微球中加入0.8-1.2μg抗原，用50mM的MES缓冲液(pH5.0)溶液将总体积补至450-550μL；用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-3hr；

-将偶联了抗原后的微球离心；

-吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s；室温避光振荡30min；

-将偶联了抗原的微球离心，吸弃上清，将微球重悬于0.8-1.2mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡10-30s，超声约10-30s后将微球离心；重复该步骤一次；

-吸弃上清，将微球重悬于250-1000μL PBS-TBN溶液中；

-包被好的微球通过计数后于2-8℃避光保存；

(2)抗体亲和力的检测：

-取出微孔滤板，确定和标记位置；将待检测的抗体进行梯度稀释；将不同浓度的抗体，分别对应加入到滤板的微孔中，每孔的量为23-28μl；

-抗原包被的微球涡漩振荡，超声处理后稀释至35-45个/μl；

-在微孔中分别加入抗原包被的微球25μl，37℃左右震荡孵育25-35min；

-抽滤，洗板三至五次；

-每孔分别加入45-55μl的2μg/ml藻红蛋白标记的抗抗体，37℃左右避光振荡孵育25-40min；

-抽滤，洗板三至五次；

-读取荧光值；

(3)数据处理。

2.根据权利要求1所述的检测抗体亲和力的方法，其特征是：所述微球活化包括以下步骤：

-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球，大约20s；

-取50μL微球离心；

-去掉上清夜，将微球重悬于100μL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，离心；

-吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s；

-加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；

-加入10μL 50mg/mL EDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；

-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。

3.根据权利要求1或2所述的检测抗体亲和力的方法，其特征是，所述离心的速度≥8000g，时间为1-2min。

4.根据权利要求1或2所述的检测抗体亲和力的方法，其特征是，所述数据处理包括以下步骤：

-将抗体浓度转换为单位是mol/L

-以10为底取对数，再取相反数

-以上述算出的数据作横坐标，以对应MFI值作纵坐标，作平滑曲线图

-拟合出曲线方程

-抗体高浓度平台MFI值减去低浓度平台MFI值，除以二，代入上述曲线方程，算出的对应横坐标数值即可作为该抗体与抗原亲和力的一个代表值。也可继续按上述步骤逆向运算得出抗体的亲和常数。