[发明专利]一种检测抗体亲和力的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物类，具体地是涉及一种检测抗体亲和力的方法。

技术背景

抗体亲和力是确定抗体性质的重要参数之一，同时，也是杂交瘤所分泌的单克隆抗体(McAb)稳定性的重要指标。它表示抗体与抗原结合的紧密程度。高亲和力的抗体对于定量检测及导向诊治是有用的，而低亲和力的抗体用于免疫纯化较好。因此，要根据应用的目的选择具有一定亲和力的抗体，就需要先对抗体亲和力进行检测。

抗体亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度，常用亲和常数Ka表示。Ka是正/逆向反应速率常数的比值，单位为稀释度单位(L/mol)，表示需将1mol抗体稀释至多少升，才能使抗原-抗体结合下降50％；而Ka的倒数为解离常数(Kd)，其单位为浓度单位(mol/L)。为了提高免疫分析的灵敏度、精密度和准确度，选用Ka值高的抗体或抗血清是非常关键的。

目前对于抗体亲和力的检测一般采用平衡透析法、酶联免疫吸附试验(ELISA)或放射免疫分析(RIA)的竞争结合试验等。平衡透析法的全部抗原抗体反应过程在均一液相体系中完成，反应的动力学过程受到的干扰因素较少，基本上完全符合质量作用定律的前提条件要求。但该法仅能测定小分子抗原与相应抗体间的亲和常数，同时要求将反应底物进行放射性标记，反应完成后又需将抗原抗体复合物与游离抗原抗体分开，实验过程繁琐、复杂，不易广泛开展。RIA虽然灵敏度高，但会造成放射性污染和危害，且存在常用放射性核素半衰期短、无法自动化分析等诸多不足。理论上采用非竞争性ELISA法测定抗体亲和常数还不十分完善。ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。同时，抗原的包被需4℃过夜，并且有多步的洗涤步骤，所需时间比较长。

液相芯片系统是生物芯片领域已经发展成熟的一项技术。

液相芯片系统包括Luminex仪器和不同荧光编码的微球等。Luminex仪器是一自动化程度极高的检测和分析仪器。荧光编码的微球目前共有100种，可检测100种与之相偶联的不同种类的目标分子。将这些微球悬浮于一个液相体系中，就可以对同一个样品中的多个不同的检测对象同时进行检测，这种检测技术称为xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling)技术。

在微球的制造过程中，掺入了两种不同的红色荧光染料，根据这两种染料的比例不同，可以把微球分为100种。在液相芯片系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的微球都带有一个独特的荧光编码。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白(抗体或抗原，用于免疫检测)作为探针分子，检测抗体中以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、检测抗体、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应物的类型；而绿色激光则检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物的浓度。

液相芯片平台的优势：

(1)高通量，多指标并行检测：液相芯片可对同一样本中不同分子同时进行分析，在35-60分钟内可对多达100种不同指标进行检测；与传统方法的逐个检测相比，这是一个质的飞跃。

(2)敏感度高，重复性好：传统的酶联免疫吸附(ELISA)技术和平面芯片技术是对分子集合的光信号进行检测得到结果，且只实现到半定量检测；而液相芯片技术则可实现定量检测，对单个微球荧光信号进行检测，计算100个微球荧光值，取其中值(Median)，所以精确度高，重复性好。早期使用液相蛋白芯片的双抗体夹心法来进行细胞因子的研究已经证明此类技术的灵敏度及检测范围比ELISA高出许多。

(3)操作简单，节约时间，样品与成本：液相芯片反应在悬浮的液相中进行，液相环境可以更好地保持蛋白的天然构象和活性，也更有利于探针和被检测物的反应，所以反应时间短。反应后通常不用清洗即可以直接检测，克服了平面固相芯片探针点样式容易发生点样错位、耗时、平行等量加样困难、加样头反复加样易发生样本间污染、重复性差等缺点，检测效率大大高于平面固相芯片。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种稳定可靠，操作简单的同时检测多种抗体亲和力的方法。