[发明专利]高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术

权利要求书

1.高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术，其特征在于：该技术的步骤及其工艺条件如下：

步骤一：宿主菌悬浮液的制备：

将宿主菌接种于常规培养基中，置于20～40℃摇床中培养12～24h，使其处于对数生长期，培养液在2～15℃，5000～8000rpm离心15～40min，保留沉淀弃去上清液，往沉淀中加入与其体积比为0.05～2％稀营养肉汤DNB培养液，即得到浓度达10¹⁸～10²⁶CFU/mL的宿主菌悬浮液，然后置于2～15℃冰箱中保存备用；

步骤二：蛭弧菌游泳体浓缩液的制备：

在稀营养肉汤DNB培养液中先加入步骤一制备的宿主菌悬浮液，使宿主菌在DNB液体中的浓度达10¹⁰～10¹⁸CFU/mL，再接入用常规方法培养出来的蛭弧菌斑，然后将此培养液在20～40℃培养20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm离心15～40min，保留上清液弃去沉淀，将上清液再在2～15℃，10000～20000rpm离心15～40min，保留沉淀弃去上清液，沉淀为蛭弧菌游泳体，往沉淀中加入与其体积比为0.05～2％DNB培养液，混匀即得到浓度达10⁶～10⁸PFU/mL蛭弧菌游泳体浓缩液，然后将此浓缩液置于2～15℃冰箱保存备用；

步骤三：高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养工艺：

配制大量稀营养肉汤DNB培养液，并加入经纤维素滤膜过滤处理后的谷氨酸钠溶液，使谷氨酸钠溶液在培养液中的浓度达0.05～10mM，再接入步骤一制得的宿主菌悬浮液，使宿主菌起始浓度达10¹⁰～10¹⁸CFU/mL，然后接入步骤二制备的蛭弧菌游泳体浓缩液，使混合培养液中的蛭弧菌起始浓度达1～10³pFU/mL后，装入发酵罐，于20～40℃进行常规发酵培养，培养过程中至少加两次宿主菌，每次间隔18～30h，并保证每次的培养液中宿主菌浓度达10¹⁰～10¹⁸CFU/mL，发酵培养4～6天后，即可得到浓度达10⁸～10¹⁴pFU/mL的蛭弧菌发酵液，最后将此发酵液先在2～15℃，5000～8000rpm离心15～40min，弃去沉淀，保留上清液，上清液再在2～15℃，10000～20000rpm离心15～40min，保留沉淀弃去上清液，往沉淀中加入与其体积比为0.05～2％稀营养肉汤DNB培养液混匀，即得到蛭弧菌游泳体发酵浓缩液。

2.根据权利要求1所述的高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术，其特征在于；步骤一所述的宿主菌悬浮液的制备中工艺条件为：将宿主菌接种于营养肉汤培养基中，置于28～32℃摇床中培养14～16h，使其处于对数生长期，培养液在4～5℃，5500～6500rpm离心18～25min，保留沉淀弃去上清液，往沉淀中加入与其体积比为0.1～0.5％稀营养肉汤DNB培养液。

3.根据权利要求1所述的高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术，其特征在于：步骤三所述的高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养工艺，发酵培养5天，前3天每间隔24h加一次宿主菌，共加三次，使宿主菌在培养液中的浓度维持在10¹⁰～10¹⁸CFU/mL，然后继续发酵培养至满5天，即得到最终浓度为10⁸～10¹⁴PFU/mL的蛭弧菌发酵液。

4.根据权利要求1或3所述的高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术，其特征在于：步骤三所述培养液中谷氨酸钠的浓度为0.5～1mM。

5.根据权利要求1或2或3所述的高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术，其特征在于：所述宿主菌是指：可被蛭弧菌裂解的各种弧菌、大肠杆菌、气单胞菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、假单胞菌或爱德华菌类致病菌菌株。